小鼠精原细胞的分离纯化.pdf

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1、42实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicinedoi：10．3969／j．issn．1674—5817．2015．01．009·论著·小鼠精原细胞的分离纯化李玉华2，段斐2，周小羽2，李扬，李润生2(1．吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室，长春130021；2．上海市计划生育科学研究所，上海200032)【摘要]目的建立一种高效、简便的分离纯化小鼠精原细胞的方法。方法利用胶原酶IV／脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)／分散酶(dispase)组合酶消化法和差异性贴壁原理，从新生小鼠睾丸中分离、纯化精原细胞

2、。经细胞形态学观察、视黄酸激活基因8(Stra8)免疫化学鉴定精原细胞并进行纯度分析。结果分离到的细胞经Stra8检测呈阳性，精原细胞纯度可达86％。结论该方法可高效地分离和纯化小鼠精原细胞。[关键词】小鼠；精原细胞；分离；纯化【中图分类号】R321．1Q95．33【文献标识码】A【文章编号】1674—5817(2015)01．0042—04哺乳动物的精子发生从精原细胞有丝分裂成精1材料与方法母细胞，再经减数分裂成圆形精子细胞，经过精子变形阶段形成精子是一个非常复杂的过程。在体1．1实验动物外研究精子的发生机制及其影响因素一直是生殖研8周龄C57BL／6J

3、Slac雄鼠5只，雌鼠10，究领域的一项重要内容，而精原细胞的获取是体外购自上海斯莱克实验动物有限责任公刮『SCXK(沪)生殖细胞研究的基本条件，冈此需要建立一种简单2012。0002]，雌雄2：1合笼。选择出生后7～8I_=J龄可行的方法，获得较高纯度和活力的精原细胞以满的小鼠作为实验对象。足实验需要。1．2主要试剂目前分离和纯化精原细胞的方法主要是组合酶胶原酶Ⅳ，脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)均购白消化法(胶原蛋白酶、透明质酸酶、胰酶等)，结Sigma公司，分散酶(dispase)购自Roche公司；胎牛血合Percoll不连续密度梯度离心⋯1、免疫

4、磁珠分选清(FBS)购自Biowest公司：兔抗视黄酸激活基冈法【2l、流式细胞仪分选法【sl等，可以得到高纯度的8(Stra8)抗体购自Abcam公刊。精原细胞。然而，这些纯化方法较为繁琐，操作1．3小鼠睾丸HE染色时间长，试剂昂贵且需要一定的仪器设备，冈而7～8口龄小鼠的睾丸经Bouin固定，常规技术限制了这些方法在实验室常规研究中的使用。操作包埋成蜡块、切片，伊红苏木素(HE)染色。作者根据现行常用方法进行了消化酶组合的优1．4小鼠精原细胞的分离化，利用差速贴壁法获得纯度和活力较高的精原细胞，参考文献方法【，，应用组合酶法以及差异性为深入研究生精机理

5、以及相关领域的研究建立基础。贴壁原理分离精原细胞，经过条件摸索和优化，采用方法如下。每组10～20只7～8曰龄雄性小鼠，腹腔注射质量分数1％(w／v)戊巴比妥钠进行麻醉。无菌【收稿日期]2015—01—25剪取两侧睾丸，放在磷酸盐PBS缓冲液中，小心【基金项目]国家自然科学基金资助项目(编号81270760)剥除睾丸的白膜，用镊子将睾丸小管磨成小段，松散[作者简介】李玉华(1974一)，女，在职博上研究生，从事生殖医的小管用移液枪反复吹打直至完全散开。用5mL学研究工作，E—mail：li_yuhua@163．cornf通讯作者]李润生，E—mail：ru

6、nshengli2007@163．cornPBS洗涤，静置沉降，去除间质细胞，收集曲精小李扬，E—mail：lyang@jlu．edu．ca管，重复该步骤2次。质量分数为0．1％(w／v)胶原实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine43酶IV+100gg／mLDNaseI溶液，37℃消化20min，化学鉴定，结果显示绝大部分细胞都呈棕色的阳性反其问每隔5min轻轻吹打一次，收集单细胞和小管，应信号(图1C)，阴性对照组(图1D)没有阳性信号。再用2U／mL分散酶+100gg／mLDNaseI37℃消化2

7、．3精原细胞的纯度分析20min左右，消化结束后反复吹打形成单细胞悬显微镜下观察并计数200个细胞中stra．8呈阳液，经过200目不锈钢钢筛过滤，1000r／min离性反应的细胞个数，结果显示分离到的精原细胞纯心5min收集细胞。度达86％。1．5小鼠精原细胞的纯化单细胞悬液加入到预先用0．1％(w／v)明胶包被3讨论过的培养皿中，用DMEM：F12(1：1)+10％(v／v)在7～8日龄小鼠的睾丸曲细精管生精上皮FBS培养基，5％(v／v)CO2培养箱中培养30min，中，主要存在2种类型的细胞，即精原细胞和支可见有大量细胞已经贴壁，小心吸取未贴壁细胞

8、置持细胞。其中A型精原细胞占17％，B型精原细于新的培养皿中，继续