时间分辨荧光免疫分析

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1、时间分辨荧光免疫分析分类体外分析中文名称时间分辨荧光免疫分析正文吋间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)是20世纪80年代初问世的一种超灵敏度的标记免疫检测技术。其主要特点是以鋼系元素错(Eu3+)等标记抗体或抗原为示踪剂,利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最犬限度地提高了检测方法的灵敏度和特异性，还具有量程宽，操作简便，标记物容易制备，稳定性好，保存期长等诸多优点。原理与放免分析相似，总体上分为竞争法和非竞争法两类，前者多用于小分子半抗原，后者用于大分子化合物。镰I系元素锹

2、Eu)、彩(Sm)、铺(Tb)和敘(Nd)通过双功能螯合剂，在水溶液中很容易与抗原或抗体分子以共价双键结合。经抗原、抗体间特异性的免疫结合反应，测定免疫复合物的荧光强度，就可推算待测物质的浓度。鋼系离子的荧光信号极弱，需要在酸性条件下，解离出銅系离子，然后与荧光增强液中的β-二酮体生成新的螯合物,经紫外光激发可产生强而持久的荧光信号，其增强效力可达100万倍，故又称解离增强鋼系荧光免疫分析(dissociation-ehanced-lanthanidefluoroimmunoassay,DELFI-A)。鋼系元素的发光时间延长，如Eu3+和Sm3+的荧光衰变时间分別

3、达到4.3×105ns和4・1×104ns,而样品和试剂中的自然本底荧光的衰变时间仅为4~10ns,通过延迟测量时间，使信号不受本底荧光影响。此外，鋼系元素螯合物的激发光波长范用宽，发射光波长范围窄，stokes位移大，有利于排除非特异性散射光的干扰，进一步提高荧光信号的特异性。试剂组成1.Eu3¯标记物可分为标记抗体、标记抗原，要求有较高的纯度、比活性和免疫活性。密封后4°C或一20°C保存，但应避免反复冻融。若发现蛋白质聚合，非特异性结合升高，则应停止使用。2.固相抗体或抗原固相载体多用聚苯乙烯微孔条，要求透明度高，吸附性能好，材质均匀，

4、孔间差异小，不同品牌其至不同批号的微孔条间都会有明显的性能差异，应引起注意。包被抗原纯度要求高；包被抗体要求效价高，亲和力强。包被后经牛血清白蛋白封闭，干燥后在4°C、密封、避光、干燥的环境中保存。3•增强液试剂纯度不高、器皿清洁度不良或不明原因的污染均可导致增强液荧光本底升高。因此必须注意试剂的纯度；批号的差异，器皿要用10g/L的EDTA·Na2。溶液浸泡，再用三蒸水洗涤。新配制增强液应用100ml塑料瓶在4°C下保存。4.校准试剂或标准品指用生物液或缓冲液配制的一组不同浓度的待测物质溶液，用于制作计量一反应曲线或用作阴、阳性对照和cutoff值校准。其浓度

5、已用法定标准物为基准进行标定，标示值与实测值的偏差不得超过士10%。蛋白质类生物活性物质应进行免疫活性测定，证明其同质性。4°C或一20°C保存。5•质量控制样品检测步骤以Wallac公司autoDELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统测定hTSH为例，其免疫反应原理为双抗体夹心法，全部试验过程均在autoDELFIA全自动时间分辨荧光免疫检测系统上按预设程序自动完成，整个检测过程用时约2・5h左右。步骤如下：（1）将100μl样品或标准品按顺序加入抗体包被的微孔条中。（2）每孔加入100μl稀释过的Eu3+标记抗体工作液。⑶孵育2ho⑷洗涤6次，除去游离Eu3

6、+标记抗体。（5）每孔加增强液200μl,反应5mino（6）测定荧光强度并经数据处理计算待测物质浓度。资料保存及报告要求所有原始记录应妥善保存，以被查考。报告内容包括患者姓名、编号、项目、送检H期、测定日期、测定结果和正常参考值，推荐使用计算机管理系统对资料进行储存、分类、查询、报告、收费和制作统计报表。质量控制质量控制的目的就是对分析工作的误差进行经常性的检查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围内O放射免疫分析的质控包括实验室内部质控和实验室间质控两个方面。前者是一个实验室对本身的分析质量进行检查和控制，后者则由地区性或全国性机构就一些项目

7、对各实验室的结果进行比较，得到共性或个性的信息，提供行政主管、生产厂家、各有关实验室参考。1.实验室内部质控的主要内容实验误差分两大类：随机误差及系统误差。前者的出现纯属随机现象，例如因各样品加样、分离、测量等步骤的差异引起复管差异过大。后者的出现则是由于整批实验发生了某一系统变化，使很多样品受到类似的影响，例如标准品浓度不准或待测样品所用加样器不准，结果所有待测样品都偏低或偏高。随机误差是不可避免的，只能将之控制在可接受的范围内，而系统误差则是可以而且应当设法避免的。实验室内质控就是要对这两类误差进行