时间分辨荧光免疫技术培训

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1、时间分辨荧光技术广州市源起生物科技有限公司培　　　训主要内容时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。TRF的标记物及特点。为什么叫“时间分辨”?TRF在免疫分析方法学中的地位。各种免疫方法学的比较。临床应用回顾标记免疫学发展放射免疫（精度：10-12mol/L）酶联免疫（精度：10-9mol/L）胶体金标记（金标：10-15mol/L）化学发光（精度：10-15mol/L）电化学发光（精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）生物芯片时间分辨荧光技术（Time-ResolvedFluorescence）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）时间分辨免疫荧光分析（TRIF

2、MA）时间分辨荧光核酸探针分析时间分辨荧光细胞活性分析时间分辨荧光探针分析时间分辨荧光技术原理（TRF）用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）时间分辨荧光免疫试剂工作原理示意图微量反应

3、孔包被好的表面抗体表面抗原V标记物轻链螯合剂Eu重链VV标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)镧系元素荧光特点：荧光寿命极长镧系元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100us样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。Stokes位移大（大约290nm）铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为28nm荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615±5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发

4、后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0时间分辨荧光免疫原理图利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零背景、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记标记位点多，可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两

5、点定标多标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目灵敏度更高，检测范围更广以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书试剂DELFIAImmuliteACS-180AFP0.1-1000IU/ml0.2-300IU/ml1.0-1000IU/mlCEA0.1-500ng/ml0.2-500ng/ml0.5-100ng/mlHCG0.5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/LTSH0.005-100μU/ml0.002-75μU/ml0.03-150μU/mlFSH0.05-256mU/ml0.1-170mU/ml0.3-200mU/mlProg0.08-120nmol/L

6、无0.1-40ng/mlProlactin0.04-250ng/ml0.5-150ng/ml0.3-200ng/ml时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5125102050100200500U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长放射性免疫分析法（RIA）应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。缺点放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个

7、欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。酶免疫分析法（ELISA）应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术曾经一度被认为是取代放免的检测手段。缺点灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因