流式细胞术工作原理及临床探究

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1、流式细胞术工作原理及临床探究流式细胞术（flowcytometry,FcM）也称荧光激活细胞分类术，是上个世纪7o年代初发展起来的一项高新技术，8o年代初研制出了稳定性能良好的流式细胞仪，开始应用到1临床医学研究及疾病的诊断和监测，目前流式细胞仪已广泛应用于生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、病理学、1临床检验等领域。流式细胞仪术具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，因而得到广泛应用和推广。1.流式细胞仪的基本结构及工作原理流式细胞术是以流式细胞仪为工具，在单细胞水平上对大量流体中的细胞或其它粒子进行高速、准确

2、、多参数的定量分析或分选，研究对象为生物颗粒（如细胞、细胞器微生物）或其它粒子（如人工合成微球等）。流式细胞仪主要由细胞流动室、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4部分组成，其工作原理是将被检测对象如细胞等制备成一定浓度的分散的细胞悬液，经特异性荧光染料染色后放人流式细胞仪的样品管中，细胞在气体的压力下进入流动室、流动室由样品管和鞘液管组成，在鞘液的约束下，细胞排列成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞液粒，经特异性荧光染色后的细胞经过激光检测区时受激光激发，产生散射光和荧光信号，通过一些波长选择通透性滤光片，可以将不同波长的散射光和荧光信号区分开来，

3、散射光是从细胞表面或细胞内颗粒散射出来的原激光光谱，其信号比较强，用光敏二级管即可检测。荧光信号较弱，需用光电倍增管接收并放大，散射光和荧光信号接收后经转换成电信号，这些信号经过加工处理储存于计算机中，用专门的计算机软件对其储存的数据进行图像处理，可在计算机上直观地统计出各种染上荧光染料的细胞的百分率，选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征如细胞大小、DNA含量、细胞表面抗源表达、癌基因蛋白等等。1.流式细胞术在免疫学中的应用FCM与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得很大的进展，并广泛

4、应用于临床医学，克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。FCM可以进行淋巴细胞亚群分析，正常人群淋巴细胞T/Ts比值大约为2/1,但在人体细胞免疫功力低下时可出现比例倒置。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估有着重要作用。已有作者报道了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值，并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨u。通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，指导治疗。例如对于肾移植后患者的肾排斥反应，如果T/T比例倒置，患者预后良好，较少发生肾排斥反应，反之排斥危险性增加］o同样此种测定技术也可用于感染及其治疗效果观察，如HIV主要侵袭CD：F

5、细胞而导致CD淋巴细胞减少，CD/CDs淋巴细胞比值下降，为艾滋病的诊断和治疗提供依据］o在其它免疫功能性疾病的诊治方面如系统性红斑狼疮(SLE)患者的淋巴细胞变化可反映该病的活动情况和器官侵犯程度。伴有严重肾脏损害的SLE患者可出现低CD：、高CD：的现象。有研究者用抗CD。单克隆抗体刺激SLE活动期和缓解期患者，然后用FCM对患者外周血T细胞CD。配体(CDoL)的表达进行分析，并证明了CDoL与B细胞表面的CD。连接后的CD。L”CD。，其刺激作用在SLE发病机制和病程中起着重要作用］o此外，FCM可以用来进行HLA群体分析。HLA”B27抗原阳

6、性与强直性脊柱炎等一系列关节病有着不同程度的正相关。FCM应用HLA”B27特异性单抗检测抗原］,其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高，同时多参数的荧光测定使我们能够在特定的细胞亚群中分析HLA-B27,还可利用FCM进行植配型移植后免疫状态检测。1.FCM在血液学中的应用除形态学、细胞化学和细胞遗传学分析外，免疫分型已成为急性白血病诊断的关键技术。各种白细胞系统都是具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对于各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用。其诊断的准确性可达到90%左右，较形态学检查准确性提高10%〜20%L7］o例如干细

7、胞表达CI)3，髓系细胞表达CD。、CD、CDB细胞系表达CD。、CD。、CDz。等，T细胞系表达CDz、CD。、CD、CD,利用FcM可以测出血细胞表达各种抗原的水平，协助I临床诊断。微小残留病变是白血病复发的主要根源，FCM以其特有的高分辨力与敏感性可在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，可及早发现，采取措施避免复发。阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是一种造血干细胞克隆病，细胞CD、CDo抗原表达减低是该病的一个特点。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CDo的表达做定量分析，可协助1临床作出诊断并判断疾病的严重程度［8］。网织红细胞计数是反映骨髓

8、造血功能的重要指标，FCM通过某些荧光染料与红细胞中RNA结合，定量测定网织红细胞中的RNA,