流式细胞术原理及应用课件.ppt

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1、流式细胞术的原理及其应用马洪星FLOWCYTOMETRY流式细胞术FLOWCYTOMETOR流式细胞仪FlowCytometryMeasuringpropertiesofcellsinflowFlowSortingSorting(separating)cellsbasedonpropertiesmeasuredinflowAlsocalledFluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)分为三大类：第一类－－台式机光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合用于临床第二类－－大型机科研型，分辨率高，可分选用于培养，可选配多种激光器，更灵活第三类－－

2、新型流式细胞仪装配有2～4根激光管，同时检测15个参数，高速分选达50000个/s流式细胞仪的主要组成部分：光路系统鞘液系统信号转换及放大系统数据处理系统流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。目前，该技术以广泛用于生物及医学基础研究与临床检测，在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域内发挥着重要作用。流式细胞仪荧光显微镜控制电脑人脑光源激光紫外光标本制备成的单细胞（或颗粒）悬液放于固定的标本台上效率高几百~几万个细胞/秒低几十个细胞/分结果精确、客观有主观因素功能可同时测多个参数、能进行分选一般只测一个参数、不能分选鞘液系统流动室光路

3、系统检测区光学原理laser抗体标记的方法抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记适用范围广,biotin-avidin不适合弱抗原的检测数据处理系统流式细胞分析的信息Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-APC流式细胞的基本信息:“形态”流式细胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合Gating常用术语流式常见图形(HistogramPlot)直方图适用于：单参数分析流式常见

4、图形(DotPlot)散点图适用于：多参数分析流式应用常见范围细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡其他（膜电位、钙离子浓度、核酸等）实验对照的设计空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时实验标本的处理单细胞悬液的制备：物理法（剪碎法、网搓法、研磨粉）化学法（酶消化）抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭－－血清和同型抗体可用流式细胞仪分析的标本外周血、骨髓、癌组织、癌旁组织、石蜡切片、各种体液（尿

5、、脑脊液、胸腹水等）必需制备成单细胞悬液单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞粒子、可溶性分子待测标本处理成单event悬液荧光素标记的单抗染色鞘液经处理的细胞单个通过激光聚焦区检测散射光、荧光信号转化、放大计算机数据处理分选SORTING（细胞分选）分选速度分选纯度分选收获率流式细胞术的应用细胞死亡分两种：凋亡和坏死细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋

6、亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。（一）凋亡的检测细胞凋亡与坏死的区别虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。　　坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。　　凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。细胞凋亡的生物学意义胚胎形成、肌体正常发育、衰老

7、和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。生物医学的研究热点凋亡检测每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）2、AnnexinV-FITC/PI法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）4、TUNEL法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚期）6、细胞凋亡相关基因的流式细胞术检测流式细胞术检测细胞凋亡亚二倍体峰（凋亡峰）---PIstaining