小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察

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1、细胞生物学实验小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察一、实验目的1.学习小鼠腹腔巨噬细胞的制备技术；2.通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬蟾蜍红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义；3.掌握小鼠腹腔注射给药及脊椎脱臼处死方法。二、实验器材显微镜，注射器，盖玻片，载玻片，滴管，试管，烧杯，离心机，离心管三、试剂1.任氏液：Nacl6.5gKCl0.14gCacl20.12gNaH2PO40.01gNaHCO30.20g蒸馏水1000ml2.阿氏液（红细胞保存液）：葡萄糖2.05g柠檬酸钠0.89g柠檬酸0.05gNaCl0.42g蒸馏水1

2、00ml调pH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min,置4℃冰箱保存。3.4%台盼蓝染液：台盼蓝4gNaCl0.9g蒸馏水100ml4．6%淀粉肉汤：牛肉膏0.3g蛋白胨1.0gNaCl0.5g蒸馏水100ml加入可溶性淀粉6.0g，加热促使溶解，再煮沸灭菌，置4℃冰箱保存，使用时以水浴融化，加入适量4%台盼蓝染液混匀。5.PBS溶液6.3%NaHCO3溶液四、生物材料1．小鼠（体重20g左右）；2．1%蟾蜍红细胞悬液：采用穿刺法处死蟾蜍后，迅速从心脏采血1ml,放入盛有4ml阿氏液的瓶中，混匀置4℃冰箱保存备用，使用前加入任氏液离心（15

3、00rpm,10min）细胞生物学实验洗涤两次，再用任氏液配成浓度为1%的细胞悬液。五、实验步骤1.先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上（或放在篮子里，方便固定），用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部1/2处的一侧注射。2.实验时，取一只小鼠，腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。（一定要刺破腹腔，不能注射到皮下）另一只小鼠，先腹腔注射1ml淀粉台盼蓝溶液，再腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。3.20-30分钟后，用CO2麻醉后再以颈部脱臼法处

4、死小鼠。4.以酒精棉球润湿小鼠腹部的表皮。用镊子提起表皮，用剪子剪一个“T”型切口5.用5ml注射器，向小鼠的腹腔内注射4mlPBS溶液。6.轻揉小鼠腹部几分钟，使悬液分散。7.将小鼠的腹膜切开一个小口，用吸管吸出腹腔渗出液，置于试管中。8.用4%NaHCO3溶液调渗出液的PH值至7.2-7.4。（半滴/ml，边加边晃动试管）9.吸取少量细胞悬液制成装片，观察巨噬细胞吞噬蟾蜍（鸡）红细胞的过程。六、实验结果(1)巨噬细胞开始吞噬蟾蜍红细胞蟾蜍红细胞巨噬细胞图1巨噬细胞紧附于蟾蜍红细胞，开始吞噬巨噬细胞细胞生物学实验蟾蜍红细胞巨噬细胞图2巨噬

5、细胞已经吞噬小部分蟾蜍红细胞蟾蜍红细胞巨噬细胞图3多个巨噬细胞吞噬蟾蜍红细胞细胞生物学实验正在消化的巨噬细胞图4巨噬细胞吞噬完蟾蜍红细胞正在消化分解七、分析和讨论本次实验旨在观察巨噬细胞在吞噬蟾蜍红细胞过程中的形态变化，而我们基本上达到了目的。但是，在实验过程中还存在着这种各样的问题，需要我们进行反思和讨论。1.实验过程中使用了两只小鼠，其中一只先在腹腔注射1ml淀粉肉汤台盼蓝溶液，而另外一只没有注射。但是，实验结果却相差不大。这可能是因为注射1ml淀粉肉汤台盼蓝溶液和注射蟾蜍红细胞之间的时间间隔过短。注射淀粉溶液的目的在于刺激小鼠体内的免

6、疫反应，从而更好地观察巨噬细胞的行为。如果间隔果断，小鼠机体未能对淀粉溶液产生充分反应，因此对于最后巨噬细胞的行为影响不大。最好能够在实验之前就给小鼠注射淀粉肉汤（含台盼蓝）溶液，方便我们进行对照。2.在给小鼠注射的过程中，我们出现了一些问题。首先，在注射第一只小鼠的时候，我们没有刺破小鼠的腹腔膜，致使溶液注射到小鼠的皮下组织，不得已只能再注射一次。注射的时候能够感受到刺破了两层膜，一层为表皮，另一层为腹腔膜。3.在注射前，需要在小鼠腹部裁剪。我很不幸地剪破了腹腔膜，致使注射后有部分溶液溢出，使得最终得到的溶液非常少。而且，在视野中还看到了

7、一些不知道名称的细胞，无法辨认。这些细胞很有可能是小鼠体内器官或血管内的细胞，对我们的观察产生了干扰4.在处死小鼠时，我们没能够一次处死，给小鼠带来了痛苦，也给实验造成了麻烦。5.在取第二只小鼠腹腔液的时候，我们揉动小鼠腹部的时间不够长，一些巨噬细胞亦然贴细胞生物学实验在腹腔器官上，没能被洗脱下来。在观察的时候，视野中的巨噬细胞很少，只能选取其中的一些区域来观察。6.在拍照的过程中也出现了一点问题。在加标尺的时候漏加了一个图的标尺。关键的图像没有放大处理，所以图像不够清晰，看不到重点。7.小鼠巨噬细胞吞噬蟾蜍血细胞的过程：巨噬细胞先通过趋化

8、性运动靠近蟾蜍血细胞，然后通过细胞间的连接蛋白粘连在细胞表面。在这个过程中，巨噬细胞的体积较小，而蟾蜍血细胞的形态较为正常。巨噬细胞通过释放细胞因子等方式破坏细胞结构，同时进行吞