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《《分子生物学检验技术》实验指导》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、实验一小鼠肝组织DNA的提取及鉴定【实验目的】1、掌握动物组织DNA提収的方法；2、掌握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA,可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直接关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋口质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和T•扰。DNA以核蛋白形式存在于细胞屮，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖
2、类等成分分离，乂耍保持DNA分子的完整。本实验小，川阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠(SDS)消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开;为控制组织中脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠(EDTA—Mh)以除去激动该酚的金属离子,SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋口质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质,接着丿IJ氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA,得到欲提取的基因组DNAo260nm处DNA有最大吸收峰，测DNA的A2
3、6o，可计算其浓度。而蛋口质在280nm处有最大吸收峰,可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8〜2.0之间。【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。3、试剂(1)基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技公司)：包括BufferCL.BufferPP^BufferGERNaseA>ProteinaseK(7)生理盐水，4°C贮存(8)无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新鲜肝脏组织50mg,
4、用预冷生理盐水洗左血液，滤纸吸干后剪碎纟R织，将剪碎组织放于纟R织匀浆器或研钵屮研磨，同时加入300plBufferCLo将肝匀浆液放入EP管，加入1.5卩1蛋白酶K,漩涡震荡10s,55°C孵育直到组织溶解(约1小时)。2、提取DNA(1)加入1.5plRNaseA,颠倒混匀，37°C孵育15-60mino(2)冰上孵冇1分钟使样品迅速冷却。(3)加入1/3体积的BufferPP,涡旋震荡20s,12000rpm离心3min。（4）将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积界丙醇，轻轻颠倒混匀，可见絮状沉淀（纤维状DNA）从溶液屮析出。120
5、00rpm离心lmim弃上清。（5）加入300
6、4170%乙醇，颠倒数次以洗涤DNA沉淀。12000rpm离心Imin,弃上清,室温干燥15min。（6）加入50
7、ilBufferGE溶解DNA（如果DNA的量比较大，可以65°C孵育以促进DNA的溶解），室温保存待测。3、DNA浓度和纯度的测定取0.1mlDNA样品,加蒸馅水至1ml,在751紫外分光光度计上测A260值和A280值。计算：DNA浓度（ug/ml）=A260x50x10（请问系数刃、』是如何得来的?）DNA纯度=A26（）nm/A280nm【注意事项】（1）由于DNA主要存在
8、于细胞核内，为便于提取DNA,肝脏的破碎耍严格控制好。即要尽可能的将细胞膜破碎，又要尽可能多保留完整的细胞核，以保留60〜70%的完整细胞核为宜。为避免DNA过度断裂，不宜用电动研磨器制备匀浆。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提，混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNAo（2）用氯仿除去纽•织蛋白，要不断振荡使蛋白质变性。如要得到高纯度DNA,可加入蛋口酶K降解蛋口质。（3）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作吋应避免接触皮肤。（4）室温卜汗燥时尽可能使残留的
9、乙醇挥发掉（DNA中残留的乙醇会影响内切陆的活性或电泳时DNA不下沉），但不要让DNA完全干燥，否则极难溶解，DNA溶解过程通常需要12-24hro（5）提取过程应尽量保持低温。（6）在波长260nm紫外线下，1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50Mg/ml；单链DNA或RNA为40Hg/ml；单链寡核1F酸为20gg/mlo据此來计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法只用于测定浓度＞0.25gg/ml的核酸溶液。（7）A26｛）nin/A28（）nin比值应介于1.8-2.0之间，若比值＞2表示DNA样品屮含有较多的RNA,如比值＜1.8表
10、明样品屮有蛋口质污染。应根据后续实验要求，采取不同的方法纯化。当然也会出现DNA溶液中既含蛋白质又含RNA,其比值介于1.8〜2.0的情况，所以有必要结合凝胶电泳等
