BOP基因的克隆及鉴定

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1、BOP基因的克隆及鉴定Bop基因克隆摘要：以PUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含冃的基因，将克隆载体PUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5ao通过氨节青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章1•前g1.1基因工程狭义上仅指基因工程。是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状

2、。重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（MolecularCloning）或基因克隆（GeneCloning）。广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为

3、指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。…基因工程产业化的基本原则。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。从实质上讲，基因工

4、程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同牛物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA,然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。[2]1.2PCR技术基本原理PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核昔酸存在下，依靠于DNA聚合酶

5、的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核昔酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将2脱氧单核背酸加到引物3’・0H末端，并以此为起始点，沿模板5’->3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA（待扩增DNA）、引物、4种脱氧核昔酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的自然复制过程，英特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①

6、模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；②模板DNA与引物的低温退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保存复制链重复循环变性•退火•延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种新链乂

7、可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。[2]1.3感受态细胞感受态细胞(competentcell)：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面岀现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。[2]1.4酶切鉴

8、定实验在重组质粒构建，重组质粒pUC18-bop采用BamHkHandIII双酶切鉴定，在对双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图