DNA测序原理和方法

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1、......DNA测序原理和方法DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABIPRISM310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】ABIPRISM310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引

2、物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收

3、峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP6)和GeneScan胶(POP4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能

4、,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】1.BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDyeMix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaqDNApolymeraseFS,反应缓冲液等。2.pGEM-3Zf(+)双链DNA对照模板0.2g/L,试剂盒配套试剂。3.M13(-21)引物TGTAAAACGACG

5、GCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。4.DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/L,即200ng/μl。5.引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。6.灭菌去离子水或三蒸水。7.0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离,PE公司产品。8.3mol/L醋酸钠(pH5.2)称取40.8gNaAc·3H2O溶于70m

6、l蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。9.70%乙醇和无水乙醇。10.NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml3mol/LNaAc混匀,室温可保存1年。11.POP6测序胶ABI产品。12.模板抑制试剂(TSR)ABI产品。13.10×电泳缓冲液ABI产品。14.ABIPRISM参考材料......310型全自动DNA测序仪。15.2400型或9600型PCR仪。16.台式冷冻高速离心机。17.台式高速离心机或袖珍离心机。【操作步骤】1.PCR测序反应(1)取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:所加试剂测定模板

7、管标准对照管BigDyeMix     1μl  1μl待测的质粒DNA    1μl  -pGEM-3Zf(+)双链DNA   -1μl待测DNA的正向引物  1μl  -M13(-21)引物-1μl灭菌去离子水 2μl  2μl总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃10s,50℃5s,

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