焦磷酸测序实验步骤

《焦磷酸测序实验步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、焦磷酸测序实验步骤Controloligo稀释配置，需要二次稀释到0.04um：第一次稀释：体积浓度Controloligo5ul20um1×Dilutionbuffer45ul第一次所得溶液50ul2um第二次稀释：第一次所得溶液3ul2um1×Dilutionbuffer147ul第二次所得溶液150ul0.04um1.微珠固定PCR产物将生物素标记的PCR产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠（StreptavidinSepharoseHighPerformance，GEHealthcare）上。1.1轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获

2、得均质溶液。1.2在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量（2ml/样品）（新的琼脂糖微珠浓度比原来的提高了一倍，只需加1ul）与结合缓冲液（40ml/样品）。添加高纯度水至80ml/孔的总体积—包括第1.4步中添加的PCR产物，纯水量取决于所用PCR产物的量。例如：如果使用15mlPCR产物、2ml微珠和40ml结合缓冲液，则必须添加23ml高纯度水。1.3将第1.2步中制备的溶液添加至24孔PCR孔板或联排管中。1.4根据孔板设置，添加5–20ml优化好的生物素标记的PCR产物至PCR孔板（或联排管）的每个孔槽。（注意：每个孔槽的总体

3、积应当是80ml。）1.5使用孔板条盖密封PCR孔板（或联排管）。确保孔槽之间没有泄漏。1.6使用振荡混合器（1400rpm）不断振荡PCR孔板（或联排管）至少5–10分钟。（注意：微珠沉淀快速，因此停止震荡后必须在一分钟内立即使用，即立刻捕获琼脂糖微珠。）2.真空工作站准备工作2.1准备以下试剂：（1）大约50ml乙醇（70%）；（2）大约40ml变性溶液；（3）大约50ml1×洗涤缓冲液；（4）大约50ml超纯水；（5）大约70ml超纯水。1×洗涤缓冲液稀释配置;体积washbuffer5ml高纯水45ml1×洗涤缓冲液50ml2.2打开真

4、空泵。打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作。2.3每次使用真空泵前要用超纯水检测过滤探针的通透性。将事先准备好的装好超纯水的离心管插在PCRplant（PCR孔槽）上，将过滤探针降入超纯水中，超纯水如在20秒内被抽空则表明过滤探针正常，可以使用。反之则需更换过滤探针。2.4取下1.6中振荡好的PCR孔板（注意：微珠极易沉淀。如果离心管振荡后放置超过1分钟，则在捕获微珠之前再次振荡1分钟），将样品放入PCRplant，小心降下过滤探针至PCR孔板中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠。（确保所有离心管中的液

5、体被吸出并且所有微珠都已被捕获到过滤探针的顶端。）2.5将真空装置移至含有70%乙醇的试剂槽1，冲洗过滤探针5秒。2.6将真空装置移至含有变性溶液的试剂槽2，冲洗过滤探针5秒。2.7将真空装置移至含有洗脱缓冲液的试剂槽3，冲洗过滤探针10秒。2.8抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液。2.9握持真空装置到Q24孔板上，关闭装置上的真空开关并悬空停留5秒，让负压散去。2.10通过左右轻摇真空装置，释放珠子至含测序引物的孔板中。2.11在真空装置关闭的情况下将真空装置转移至含有超纯水的试剂槽4，振荡10秒。2.12降下探针至含超纯水的第

6、二个试剂槽5中并施加真空，清洗探针。用70ml超纯水冲洗过滤探针。2.13抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液。2.14关闭真空装置上的开关，并将其置于静止（P）位。3.分离DNA单链并将样本释放到PyroMarkQ24孔板中3.1将PyroMarkQ24孔板放置在预热的孔板底座上80℃精确加热2分钟。3.2从孔板底座上取下孔板，使样本在室温（15-25℃）下至少冷却5分钟。4.PyroMarkQ24试剂的准备4.1打开PyroMarkQ24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管。4.2按照试剂盒说明书用超纯水溶

7、解并分装酶和底物（溶解后的酶和底物需在-20℃保存，最多可反复冻融3次，核苷酸只能在4℃保存。），所有试剂需恢复室温后再使用。4.3依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C（试剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的）4.45.在PyroMarkQ24仪器上的运行5.1打开PyroMarkQ24软件，点击newassay→newAQassay→在sequencetoanalyze中输入突变点序列，点击generatpupensationor，点击保存；5.2点击newrun→Instrumentmethod→

8、007，然后点击要测序的格子，点击保存至U盘。5.3将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。5.4把加热好的孔板放到仪器上。5.5将试剂仓（酶