最新焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方法PPT课件.ppt

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1、焦磷酸测序技术检测猪甲型流感病毒方法内容焦磷酸测序技术在动物检疫中应用的意义焦磷酸测序的原理焦磷酸测序检测猪A型H1N1流感的操作过程焦磷酸测序用于猪流感检测的意义猪A型流感：猪可能作为禽、猪、人流感病毒传播中唯一的共同易感宿主，其呼吸道上皮细胞同时具有人、禽流感病毒的受体，所以猪流感病毒具有感染人的潜力并作为流感病毒的“混合器”,在禽—猪—人的种间传播中起到非常重要的作用。焦磷酸测序用于猪流感检测的意义RT－PCR、荧光RT－PCR此类方法虽特异灵敏，但可能存在假阳性反应。解决办法，目前对可疑结果一般采用RT－PCR产物序列

2、测定进行确证。焦磷酸测序用于猪流感检测的意义焦磷酸测序技术——分子诊断的黄金标准特异性、灵敏性远远低于病毒分离鉴定方法，可能存在假阳性反应。实时荧光RT-PCRRT－PCR测序确证遭遇瓶颈瓶颈：DNA序列测定做分子克隆，需要样品量大周期长，口岸采样一般采集咽喉试子，经实验前处理后，所剩样品较少，且病原含量较低，PCR产物量根本达不到传统测序所需要的量，无法进行测序工作。本课题的主要技术手段——焦磷酸测序Pyro+Sequencing=Pyrosequencing焦磷酸技术测序技术焦磷酸测序Pyrosequencing是将焦磷酸

3、技术应用于DNA序列分析的新一代技术分子水平上的研究最佳选择——获得分子诊断的黄金标准——基因序列——测序焦磷酸测序用于猪流感检测的意义PPiATPAPS＋Luciferin＋硫酸化酶双磷酸酶荧光素酶lighttimePyrosequencing原理DNA聚合酶实时和定量序列分析结果Samplesequence：AGGCAGTTCGAC12345678910110-1AGGCAGPyrosequencing焦磷酸测序技术的特点Pyrosequencing焦磷酸测序技术的特点实验设计灵活InterestregionRPKHDFP

4、BSeqForwardsequencingReversesequencingMultiple－sequencingprimersInterestregionSeqRPBNNtgRcFP试验设计理念中心理念代表各亚型目标序列的比对寻找血凝素基因神经氨酸酶基因鉴于最新爆发H1N1甲型流感病毒变异点较多，特选取该株独有且变异点较为集中的区域作为目标序列实验步骤PCR检测双酶切检测目的基因阳性菌测序获得阳性克隆菌BioFlux回收试剂盒回收连接与转化RT-PCR引物设计提取模板灭活病原提取质粒M基因及亚型基因的质粒构建采样及样品的处

5、理鼻腔拭子肌肉或组织脏器应尽可能多保留一些样品，因为流感的特殊性，可能需要重复实验。RNA提取采用常规方法试剂只要适合于RNA提取即可试验进程（PCR）及电泳直接进行H1、N1基因的PCR扩增采用两步法电泳检测PCR扩增结果根据提供的扩增片段长度确定是否扩增到目标片段如有杂带，可以增加纯化步骤试验进程及结果PCR试样预处理Pyrosequencing反应实验流程：分离纯化单链开机，并拿出试剂，在使用前，保证所有试剂都达到室温混匀磁珠，在Mixer上常温混匀10分钟，每样约3μL加入结合缓冲液到50uL将50μL标记有生物素的P

6、CR产物与50μL链霉亲和素包被的磁珠混合，在室温25℃下振荡孵育20min。用真空吸附器将与磁珠结合后的PCR产物吸起，然后在纯水中清洗30s；在70%乙醇中清洗5s；变性缓冲液洗5s；最后移到洗涤缓冲液中清洗10s。空吸附器放入含有测序引物的板中，摇动，释放磁珠。将样品放入80℃烘箱2min，再冷却到室温。InstrumentdesignReagentcartridge96wellplateCCDcameraX-YdriveInkjetdeliveryMixerandthermostatDetectionPositioni

7、ngTACG实验流程：Pyrosequencing检测测序反应测序反应在28℃下于焦磷酸测序仪上检测，加样使用600mbar/8msec的加样压力和时间，每轮反应时间65秒。引物链随着不同dNTP的加入而延伸。随着核酸的结合，CCD摄像机检测到发出的光信号，读出DNA序列。标准的结构结果判定猪甲型H1N1流感病毒的确定：H1和N1RT-PCR反应均为阳性的，进行焦磷酸测序分析，测序片段与H1、N1目标片段完全相同的，确定为猪甲型H1N1流感病毒亚型。H1和N1RT-PCR反应均为阳性的，H1和N1测序片段与目标片段有一个以上碱

8、基不同定为可疑，进行HA或NA基因全序列测定，确定其亚型。H1、N1RT-PCR反应全部或有一个为阴性的判定为非猪甲型H1N1流感病毒。标准的结构结果判定甲型H1N1流感病毒的确定中确定为猪甲型H1N1流感病毒的样品，建议采用本标准附录B.3中的引物，按本标准的方法及判定依据