GST亲和层析介质使用说明书

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1、GST亲和层析介质使用说明书一、  简介GST亲和层析介质（GSTAgarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。二、  性能参数特点基团密度高，载量大基质6%的交联琼脂糖凝胶吸附载量≥15mgGST融合蛋白（55kDa）/ml介质平均粒径100μm最大流速300cm/hpH范

2、围3~10，在位清洗时pH范围可到2~11使用温度常温保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇化学稳定性室温下可在0.1M柠檬酸(pH4.0)，0.1MNaOH，70%乙醇或6M盐酸胍中耐受2h，蛋白结合能力不受影响三、  适用范围分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。四、  操作说明1. 缓冲液配制      缓冲液A（平衡缓冲液）：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，调节pH值至8.0。      缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mMGlutathione（还原型），50

3、mMTris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione易氧  化，需现用现配。（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45μm滤膜过滤备用)。2. 样品预处理：按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。3.   装柱：      聚苯乙烯层析柱1)  将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向

4、底部，避免垫片下方滞留气泡。2)  打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)  从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。4)  在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述    玻璃层析柱1)  将层析柱洗净后垂直固定到铁

5、架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。2)  先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。3)  从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。4)  在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。4.  过柱：1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；2) 上样；3)   用5~10倍介质体积缓

6、冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；4)   用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液；5)   用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。5. 介质清洗如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。步骤如下：1) 沉淀或变性物质的清洗：用2倍介质体积6M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。2) 疏水缔合物质的清洗：用3~4倍介质体积70%乙醇(或2倍介质体积去垢剂，如1%Triton™X-100)清洗介质；然后用5倍介质体积缓

7、冲液A平衡介质。6. 介质再生每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生，步骤如下：1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1MTris-HCl,0.5MNaCl,pH8.5）和低pH缓冲液（0.1Msodiumacetate,0.5MNaCl,pH4.5）交替洗脱三次。2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。7.   SDS-PAGE检测：1)   不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围分离胶浓度分离范围6%50～150kD8%30～90kD10%20～80kD12%12～60kD 15%10～40kD2)   SDS-PAGE操作流程