DB13_T2404-2016猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS65.020.20B05DB13河北省地方标准DB13/T2404—2016猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法2016-09-30发布2016-12-01实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2404—2016前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、孙继国、宋勤叶、马增军、金东航、李丽敏、张磊、李睿文。IDB13/T2404—2016猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测猪粪便

2、、腹泻猪胃肠及其内容物和这些采集样品培养物中的猪流行性腹泻病毒。2缩略语下列缩略语适用于本文件。DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）；dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）；EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）；PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）；RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）；RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）；V

3、ero细胞：非洲绿猴肾细胞；cDNA：互补脱氧核糖核酸。3主要仪器3.1PCR仪。3.2凝胶成像系统。3.3台式低温高速离心机。3.4电泳仪。3.5电泳槽。3.6冰箱。3.7微量移液器。3.8水浴锅。4主要试剂4.1LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。4.2氯仿。4.31.0%琼脂糖凝胶：见附录A中A.1。4.450×TAE缓冲液：见附录A中A.2。1DB13/T2404—20164.510ug/μLEB或核酸染料：见附录A中A.3。4.6DEPC处理的灭菌的双蒸水：见附录A中A.4。4.7DNA分子量标准（100bp）。4.8反转录酶

4、。4.9RNA酶抑制剂。4.102×TaqMasterMix（Dye）。4.11dNTP。4.12商品化的一步法RT-PCR反应试剂：含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。5引物上游引物与下游引物见附录B。引物浓度为10μmol/L。6样品对照以灭活的猪流行性腹泻病毒Vero细胞培养物或者感染猪粪便、肠粘膜作为阳性对照，以正常Vero细胞培养物或者是正常猪粪便、肠粘膜作为阴性对照。7操作步骤7.1样品的采集与处理。7.1.1采集工具采集工具应经121℃±2℃，20min高压灭菌并烘干。采集工具如下：a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；

5、d)1.5mL离心管；e)研钵。7.1.2粪便采集将棉拭子深入肛门转一圈沾取粪便；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（见附录A中A.5）的1.5mL的离心管，加盖，编号。7.1.3胃或肠及内容物的采集用绳子将胃或肠两端扎紧，用剪刀采集胃肠等，装入一次性灭菌容器，编号。7.1.4样品储运2DB13/T2404—2016样品采集后放入密闭的塑料带内（一个采集点的样品放一个塑料带内），于保温箱中加冰，密封24h内送至实验室。7.1.5样品的处理7.1.5.1棉拭子处理方法样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，4℃条件下3000

6、r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。7.1.5.2胃或肠及内容物的处理方法将所采集的胃或肠及内容物至于洁净，灭菌并烘干的搪瓷盘中，抽取内容物或者取刮取胃肠粘膜按照质量体积比（1:1）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。7.2RNA的提取7.2.1用LSTRIzol试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的RNA。7.2.2将250μL经过预处理的待测样品加入750μLTRIzolLSReagent中，振荡2min，室温放置5min。7.2.3

7、加入250μL氯仿，在微量振荡器上振荡1min，室温放置5min后，4℃条件下12000r/min离心15min。7.2.4吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置15min，4℃条件下12000r/min离心15min。7.2.5小心吸弃上清液，加入DEPC处理的75%乙醇700μL～800μL，4℃条件下12000r/min离心5min。7.2.6小心吸弃上清液，将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，加适量的DEPC水溶解。7.2.7提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，须至于-80℃的冰箱保存。7.2.8也可采

8、用商品化的RNA提取试剂，按照说明书进