DB34∕T 2515-2015 猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T2515—2015猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法RT-PCRassayforporcineepidemicdiarrheavirus文稿版次选择2015-11-10发布2015-12-10实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2515—2015前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。本标准由安徽省农业标准化委员会归口。本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：潘孝成、张丹俊

2、、赵瑞宏、沈学怀、周学利、胡晓苗、戴银、侯宏艳、李贺侠、张宁、何国荣、周德权、王庆。IDB34/T2515—2015猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR检测方法及其技术要求。本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。2缩略语下列缩略语适用于本文件。PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）PCR：聚合酶链式反应（polymerasech

3、ainreaction）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS

4、：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）3原理PEDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。4仪器4.1PCR仪扩增仪。4.2台式低温高速离心机。4.3电泳仪。4.4凝胶成像

5、系统。4.5冰箱。4.6微波炉。4.7分析天平。1DB34/T2515—20154.8水浴锅。4.9微量移液器。5试剂和材料5.1RNA抽提试剂：Trizol。5.2氯仿、异丙醇、乙醇。5.3M-MLV反转录酶。5.4RNA酶抑制剂。5.5DEPC处理的灭菌水。5.6TaqDNA聚合酶。5.7dNTP。5.8DL2000DNAMarker。5.9RT-PCR反应试剂。5.10溴化乙锭（EB，10µg/µL）或核酸染料。5.11磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的A.1。5.1250×

6、TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。5.131％琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。5.14引物：——上游引物5’-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3’，——下游引物5’-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’，——引物浓度10pmol/µL。5.15阳性对照样品：PEDV接种的VERO细胞培养物，阴性对照样品：正常VERO细胞培养物。6操作步骤6.1样品的采集及处理6.1.1采样工具15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。6

7、.1.2肠内容物的采集与处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，按1:5倍体积加入PBS，研磨冻融3次，装入15mL灭菌离心管中，8000rpm离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6.1.3粪便的采集与前处理取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入PBS，混匀，8000rpm离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6.1.4细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。6.2RNA提取2DB34/T2515—20156

8、.2.1用Trizol提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的RNA。6.2.2200μL的样品和800μLTrizol置于一个1.5mL离心管，反复颠倒混匀，室温静置5min。6.2.312000g4℃离心5min，吸取上清移入新的离心管中，加入200μL氯仿，用手剧烈振荡15s，室温静置5min。6.2.412000g4℃离心15min，吸取上层水相移入新