细胞核的分离纯化实验.pdf

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1、细胞核的分离纯化一、实验目的1、初步掌握细胞核分离纯化及核酸定量测定的原理与方法。2、通过本次实验，结合以前学过的其它生化技术，初步了解亚细胞结构的分离、提纯、鉴定和细胞内成分的定量测定的一般方法。3、熟练掌握普通离心机的使用，在此基础上了解高速、超速离心技术。二、实验内容1、小鼠肝匀浆的制备。2、细胞核的分离与纯化。3、RNA的测定。4、DNA的测定。三、实验原理1、分离原理：在研究细胞内各部位的结构与功能，及各细胞器在细胞活动中所起作用时必须有一整套完善提取某一细胞成分的方法，从而进行深入研究。以肝细胞核的提取为例，了解一般分离提取的基本

2、原理和方法，动物肝脏用1.5％柠檬酸溶液制成匀浆，经离心分离出细胞核和细胞质。细胞核部分再进一步在蔗糖柠檬酸溶液中离心纯化，可获得初步纯化的白色细胞核沉淀。2、测定原理细胞核中核酸组成与细胞质不同，细胞核内含大量DNA，而RNA较少，细胞质中则RNA含量丰富。RNA在碱性溶液中水解后，其核糖部分可被浓酸脱水形成糠醛，后者能和3,5－二羟基甲苯缩合成绿色化合物。DNA在过氯酸溶液中加热水解后，其脱氧核糖部分在浓酸中生成ω一羟基γ一酮戊醛等化合物，再进一步与二苯胺作用，可产生蓝色化合物。四、试剂与器材1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3mm

3、ol/LCaCl）2称取蔗糖86g及CaCl363mg，用1.5％拧檬酸液溶解并2稀释至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaC）2称取蔗糖301g及CaCl363mg，用1.5％柠檬酸液溶解2并稀释至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/LNaCl液。在0.2mol/LTris—HClpH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。4、1.5％拧檬酸5、0.9％NaCl6、0.02NNaOH7、离心机8、水浴箱9、常规玻

4、璃仪器五、操作步骤（一）细胞核的分离1、肝匀浆制备：颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速取出肝脏，用生理盐水洗去血液，除去结缔组织，剪碎。称取0.5克肝组织，加10倍体积（约5ml）的1.5％柠檬酸溶液在匀浆器中制成匀浆，将匀浆液用双层纱布过滤，以除去残渣。2、分离细胞质与细胞核：将匀浆液全部倾入离心管中，以4000rpm的转速离心15分钟，上层液含细胞质，倒于另一试管中保留，待测定核酸。沉淀为粗制的细胞核，在细胞核中加入1ml0.25mol/L蔗糖拧檬酸溶液，用玻捧搅匀，成为核悬液。另取离心管一只，加0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取

5、上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000rpm转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。此为初步纯化的细胞核。用Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗涤沉淀以2000rpm离心10分钟，除去上层液。再重复洗涤一次白色沉淀即为纯化的肝细胞核。加5ml0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。（二）核糖核酸的测定1、水解：取离心管二只，编号，按下表操作：编号12细胞质（ml）1.0——核液（ml）——1.0KOH（ml）1.01.0混匀各管，置沸水浴煮沸10分钟，

6、取出冷却。加8ml5%三氯醋酸搅匀。使蛋白质及DNA沉淀，2000rpm离心5分钟，其上清液为RNA的碱水解液。2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作。编号123细胞质水解液（ml）1.0————核液水解液（ml）——2.0——5％三氯醋酸（ml）1.0——2.03,5一二羟基甲苯液（ml）3.03.03.0立即混匀，沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，比较各管颜色有何不同。（三）脱氧核糖核酸的测定1、水解：取离心管二只，编号，按下表操作：编号12细胞质（ml）2.0——核液（ml）——2.0过氯酸（ml）2.02.0混匀各管，置沸水浴煮沸10分

7、钟，取出冷却。2000rpm离心5分钟，其上清液为DNA的水解液。2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作。编号123细胞质水解液（ml）2.0————核液水解液（ml）——2.0——过氯酸（ml）2.0——2.0二苯胺（ml）4.04.04.0立即混匀，沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，比较各管颜色有何不同。