实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

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1、实验二血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳（Celluloseacetatemembraneelectrophoresisofserumproteins）盐析法沉淀法有机溶剂沉淀法离子交换层析吸附层析分离方法层析法凝胶过滤（分子筛）电泳法亲和层析电学法等电聚焦超速离心法电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可对它们进行分离。以蛋白质为例：-COOCO

2、O-COOHH＋＋HPrPrPrOH－OH－NH+NH2NH+33pH>pIpH=pIpH

3、β－球蛋白5.1290,000～150,0006.5～12γ－球蛋白6.85～7.3156,000～950,00012～20v缓冲液pH=8.6vpI＜pH血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动1、电泳仪及电泳槽2、醋酸纤维薄膜（2×8cm）3、培养皿4、点样器（盖玻片）5、滤纸6、玻璃板（可用大培养皿背面代替）7、镊子8、毛细管9、刀片1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06)2、0.5%氨基黑10B染色液3、漂洗液100ml4、透明甲液和乙液各20ml5、人血清（严格防止血

4、清沾到皮肤上，尤其是带有伤口的皮肤）1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择将醋酸纤维素薄膜浸于缓冲液中约30min后，取醋酸纤维素薄膜放在滤纸中并吸干表面液体。整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。2.电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成滤纸桥。3.点样：点样前，取一张干净的滤纸，在距一边1.5cm处用铅笔划一条平行线作为点样标志区。点样时，用毛细管

5、吸取血清，在盖玻片一端均匀涂抹，使样品连续、均匀、适量，把盖玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下（盖章法）。点样区距阴极端1.5cm（见图）。此步是实验的关键。6.5cm1.5cm点样区醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（黑线处为点样位置）4.电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度（8片薄膜则为4.8mA）。通电10-15min后，调节电流强度0.5

6、mA/cm膜宽度（8片薄膜则为8mA），电泳时间50-80min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。5.染色：电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5min，染色时可置于摇床，染色液用后回收到原瓶。6.漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，取出薄膜放在滤纸上，用吹风机冷风吹干或者自然晾干。7.透明将干燥的薄膜浸入透明甲液2min后转入乙液1min，取出后贴于干净玻璃板上，中间不能有气泡，等待至薄膜透明，如果透明太慢可用乙液淋洗一次。

7、透明后冷风吹干燥，置于自来水下冲洗，等薄膜湿润后用刀片从一角撬开并轻轻取下，滤纸吸干水分后即可。如需长期保存可在液体石蜡中浸润。8.记录和分析实验结果透明后可将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录，并判断分析结果。透明后的薄膜可作扫描或照相。正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样原点1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，薄膜吸水量以不干不湿为宜。3、点样时

8、，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏薄膜或印出凹陷影响电泳区带分离效果。4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。1.用醋酸纤维薄膜电泳做电泳支持物有什么优点？2.电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端