实验2：分离以尿素为氮源的微生物.ppt

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1、实验2：分离以尿素为氮源的微生物尿素是蛋白质降解的产物，通常用作植物的氮肥。但是植物的根几乎不吸收尿素，尿素经微生物(脲酶)分解为氨,氨溶解于水中成为铵根离子而被植物吸收。一、基础知识1、尿素(脲)：大量尿素的存在会对环境造成污染，如土壤板结、肥料利用率下降、地下水污染等。例如：2、选择培养基：添加或减少某种成分，以允许某种微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。培养基中缺乏有机碳源时可筛选出自养型微生物只以尿素为氮源的培养基可筛选出含脲酶的微生物一、基础知识3、玻璃砂漏斗：玻璃砂(砂

2、芯)漏斗有6种：G1~G6(砂芯含有不同规格小孔)。G6孔径最小，细菌不能滤过。若培养基中含有不能加热灭菌的化合物，如尿素(加热会分解)等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤来除去微生物。玻璃砂漏斗用前也要进行高压蒸汽灭菌(121℃，15min)。用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。体积调节按纽吸头脱卸按纽容量显示窗吸头(枪头)套筒弹性吸嘴一、基础知识4、移液器：移液器是一种在一定容量范围内可随意调节的精密取液装置（俗称移液枪）。（1）结构：（2）使用方法：各

3、种规格吸头各种规格移液器移液器的使用根据取用溶液体积选用适当的移液器操作方法：设定体积安装吸头吸液放液卸掉吸头从大值调整到小值时，逆时针旋转体积调节按纽到刚好即可。从小值调整到大值时，应顺时针先调至超过设定值后再回调。设定体积安装吸头将移液器顶端垂直插入吸头，再轻轻用力下压的同时，左右微微转动，上紧即可。切记用力不能过猛，选择与移液器匹配的吸头。吸液1、预洗吸头：吸取、排放样液2~3次，让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度。一般液体，正向吸液(将按钮按到第一档释放吸液)粘稠液体和易挥

4、发液体，反相吸液(将按钮直接按到第二档吸液)2、垂直吸液、慢吸慢放：吸头垂直浸入液面2-4mm。尽量避免吸头浸入液面过深，以免液压对吸液的精确度造成影响。吸液速度切记不能过快，以免导致液体吸入移液器内部。将移液枪提离液面需停约1~3秒，观察是否有液滴缓慢的流出。若有流出，说明有漏气现象。放液吸头紧贴容器壁放液。按钮要待液体完全打出后再放松。正向：先将按钮按至第一档，略作停顿以后，再按至第二档，这样做可以确保吸液头内无残留液体。反向：轻按按钮至第一档，排出液体。继续按住按钮，将留在吸头中的多余液体返回

5、原来容器或随吸头丢弃。卸掉吸头一般用力下按吸头脱卸按纽即可卸掉吸头。将吸头丢弃到废物收集器中。移液器如不使用，将刻度调到最大量程，使弹簧恢复原形，延长移液器的使用寿命。（一）实验目的：1、使用专一的培养基（尿素为惟一氮源）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。2、使用指示剂（酚红）颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。本实验的内容是：用尿素固体培养基从土壤中分离出能利用尿素的细菌，观察菌落数；并以LB全营养固体培养基为对照，观察全营养培养基上的菌落数。二、实验内容比较两者的菌落数，可知能利用尿素的细菌在土

6、壤菌群中所占的比例（二）实验原理：在土壤中，存在一些细菌，它们含有脲酶，能分解尿素(脲)作为其生长的氮源(NH3)1.利用尿素培养基(以尿素为惟一氮源的选择培养基)，分离出土壤中含脲酶的细菌。2CO32NH2OH+¾¾®¾+脲酶22)(ONH=C二、实验内容2.细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，致使PH升高，使酚红指示剂变红。二、实验内容（三）设备及用品：略（四）材料2、全营养LB固体培养基：蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂糖、水。3、尿素固体培养基：葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖

7、、水、尿素。1、100mL烧杯：装有50mL70%酒精，浸泡着玻璃刮刀6、土样：从有哺乳动物排泄物的地方取（粪便中含尿素，利于含脲酶的微生物生长）4、5支有塞试管：盛有4.5mL蒸馏水5、250mL三角瓶：盛有90mL蒸馏水为什么要设置全营养LB固体培养基？起对照作用。土壤中含有多种细菌，在全营养LB培养基中，多数细菌都能生长；而在仅以尿素为氮源的培养基中，只有含有脲酶的微生物才能生长。1、为什么用琼脂糖替代琼脂作为固化剂？酚红在此起什么作用？琼脂是末被纯化的混合物，内含有一定量的含氮化合物。如果用

8、琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。酚红为酸碱指示剂，在酸性环境呈黄色，在碱性环境呈红色。通过酚红的颜色变化，可检测培养基中pH的变化。思考与练习：注意：取样时尽量只取悬液。称量—溶化—调PH—分装—加塞封口—包扎—灭菌二、实验内容（五）实验步骤：1、配制培养基并灭菌2、倒平板3、制备细菌悬液4、用涂布分离法分离细菌5、细菌培养6、观察、对比全营养LB固体培养基和尿素固