引物设计实例分析.ppt

《引物设计实例分析.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、引物设计实例分析引物设计基本原则引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）阅读框1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度2.产物的长度扩增片段长度为100~600碱基对.3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证

2、上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)4.引物的GC含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物自身引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败1.打开软件，调入序列2、选择路径，选择序列文件名，加入右框3、序列文件显示如图，点击“primer”；4.按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“确定”进行引物

3、搜寻5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“确定”。6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构情况，依次筛选PrimerPremier5的引物评价窗口任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgc

4、actcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccaca

5、agcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtcca

6、gcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaaNR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTG

7、CCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACC

8、ATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCA