免疫荧光染色方法.doc

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1、.免疫荧光染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗

2、体进入与抗原结合。常用抗原物质的固定方法抗原物质          固定剂 固定条件（min）蛋白质抗原 95%～100%乙醇 室温3～10酶、激素 丙  酮 4℃  30免疫球蛋白 四氯化碳  病    毒 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 室温5～10或4℃ 30～60    多糖、细菌等   微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮 室温5～10或4℃30～60类    脂      10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol） 室温3～10..免疫荧光染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块

3、剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。常用抗原物质的固定方法抗原物质          固定剂 固定条件（min）蛋白质抗原 95%～100%乙醇 室温3～10酶、激

4、素 丙  酮 4℃  30免疫球蛋白 四氯化碳  病    毒 丙酮、四氯化碳、无水乙醇 室温5～10或4℃ 30～60    多糖、细菌等   微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮 室温5～10或4℃30～60类    脂      10%甲醛，10%佛茂尔（ForMol） 室温3～10..（异嗜性抗原）（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/LpH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。1．材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。（2）0.01Mol/LpH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为

5、甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30min～45min。（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。（3）蒸馏水冲洗。（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。2．间接染色法（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃..孵育30min；④PBS3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。（2）检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，

6、甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。（五）结果显示荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。荧光强度的表示方法如下：＋＋＋～＋＋＋＋：荧光闪亮，呈明显的亮绿色。＋＋：荧光明亮，呈黄绿色。＋：荧光较弱，但清楚可见。±：极弱的可疑荧光。－：无荧光。（六）标本保存由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时

7、间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。..保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂，如特别的荧光封固剂（Fluormount）或碱性优质纯甘油固剂等封固。这些封固剂能防止荧光激发，封固后低温保存；④可以采用拍照保存照片。荧光原位杂交（FISH）实验步骤仪器设备    1、医用微波炉；    2、水浴锅；    3、OLYMPUSBX51荧光显微镜；     4、OL