免疫荧光染色.doc

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1、免疫荧光一般步骤固定液配制：常用固定液为4%多聚甲醛，将40g多聚甲醛粉剂在三角烧瓶中溶于1000ml0.1MPB溶液中,放入磁力转子置于加热磁力搅拌器中加热溶解，温度切忌超过70℃，温度过高会导致多聚甲醛解聚成为甲醛，遮蔽抗体影响抗原抗体结合，溶解后待其冷却，调节PH值至7.4，过滤后室温或4℃放置备用，配好后一个月内有效，最好现配现用。2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.２H2O　3.74g；Na2HPO4.12H2O　45.11g（500ml:1.87g,22.55g）灌注固定：快速生理盐水冲净血液（

2、约需要100ml即可），4%多聚甲醛灌注（快速充灌100ml左右，再慢速滴150ml）。灌注用的针头前端要磨平，灌注小鼠可以用较粗的头皮针，仅留1cm，插入左心室即可，不必像大鼠那样插入主动脉根部。取材按要求不同取组织，取材部位一定要事先确定好，比如脊髓呈现节段性变化，只有取到正确的部位才能获得结果。坐骨神经对应的脊髓阶段（３，４，５）在第一腰椎下，第五腰椎下是第五神经节，对应髂前上棘（动物其实不叫这个名）前缘。后固定及蔗糖脱水：组织取材后切成小块放入4%多聚甲醛中，为后固定，建议4℃过夜，随后转入40%蔗糖溶液中脱水（不沉底），3天后即可用于冰冻切片。后固定时间亦不可过长。

3、脱水不彻底表现为组织切片上空洞样组织破坏；固定不完全表现为微米染色集中在周边，组织内部不着色。蔗糖溶液亦用0.1MPB配制（见附录）。冰冻切片：漂染时，脊髓片厚可以25~30微米，神经节片厚要30微米免疫荧光染色：1.TBS溶液清洗组织片5分钟×2，有利于抗原抗体结合（可选）2.封闭液（10％血清+1%BSA）＋0.3%triton-100*室温封闭2小时，亦可4℃过夜，除个别膜抗原外，都需要加triton-100*;个人习惯的做法是把封闭液分装成1ml/管，保存在-20度，用前添加3微升triton-1003.一抗孵育4℃过夜，一抗浓度需要通过预实验进行确定，比较常见的是１

4、μｇ／ｍｌ。（一抗稀释液见附录，建议用）4.TBS溶液清洗组织片5分钟×35.二抗孵室温两小时或4℃过夜，感觉背景深的话,建议4℃过夜。6.TBS溶液中置于摇床上清洗组织片5分钟×37.暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不是光线直射就可以

5、。8.90%甘油封片，注意汽泡。90%提前配好，用一个20ml玻璃小瓶或者试管，加入甘油和PBS（或者TBSOR生理盐水）混匀，放置以消去气泡。封片时甘油通常会加多，可以在封片后用卫生纸或者滤纸在边缘吸取多余的甘油，以防止粘到显微载物台上。1.荧光观察2.荧光双标与单标程序相同，也可顺序标记，购买带有相应荧光标记的一抗是个好办法。购买抗体后首先是确定抗体的有效性并确定抗体的工作浓度，有效性是通过阳性对照（有蛋白表达的组织标本）来实现，确定抗体的工作浓度要用不同的稀释比例分别染来实现，比如1：100，1：200，1：500，三个浓度，可以节约抗体，用加有叠氮钠的抗体稀释液（见下

6、）也可回收抗体保存在4度，可用2-3次；抗体一般要分装保存在-20度，解冻用不完的抗体可4度保存两周；阴性对照也是必须的，即不加一抗只加二抗，特别是染新蛋白的情况下。附：1.Tris缓冲液配方（0.5M,PH7.6　10×）：Tris　60.57g；1N　HCL(N是当量,相当于一元有效物1M，1N盐酸桐当于1M盐酸，而1N硫酸相当于0.5MT硫酸)约420ml　双蒸水加至1000ml　先以少量双蒸水溶解Tris,加入HCL后，调至7.6，此液为储存液,4℃保存。2.TBS配方:Tris-HCL缓冲液100ml加NaCl8.5～9g双蒸水加至1000ml3.一抗稀释液：15M

7、m/LNaN3,1%BSA,0.01M/LPBSPH7.44.甲醛明胶:40%甲醛2.5ml,明胶0.5g蒸馏水至100ml,配制方法：用少许蒸馏水（约80ml）加热溶解明胶，待完全溶化后，加入甲醛，最后补充蒸馏水至100ml混匀即可。5.0.1MPB：Na2HPO412H2O28.7g,NaH2PO42H2O2.96g,用1000ml双蒸水溶解。6.2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.２H2O　3.74g；Na2HPO4.12H2O