芋头病毒检测技术规程（定稿）.doc

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1、ICS65.020B16DB37山东省地方标准DB37/T××××—××××芋头病毒检测技术规程Detectionandidentificationoftaroviruses××××-××-××发布××××-××-××实施山东省市场监督管理局发布DB37/T××××—××××前言本标准由山东省农业农村厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。5DB37/T××××—××××芋头病毒检测技术规程1　范围本标准规定了芋花叶病毒（Dasheenm

2、osaicvirus，DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）的RT-PCR的检测方法。本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3　检测对象3.1　芋花叶病毒中文名：芋花叶病毒学名：Dasheenmosaicvirus缩写：DsMV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y

3、病毒属（Potyvirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为750nm。一般通过蚜虫传播，还可通过机械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。3.2　黄瓜花叶病毒。中文名：黄瓜花叶病毒学名：Cucumbermosaicvirus缩写：CMV分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径28nm～30nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。4　主要仪器设备、用具和

4、试剂4.1　仪器设备和用具仪器设备和用具主要有：a)PCR仪；b)电泳仪；c)水平电泳槽；5DB37/T××××—××××a)凝胶成像仪；b)高速冷冻台式离心机；c)纯水仪；d)万分之一天平；e)普通冰箱（0℃～4℃）；f)-20℃低温冰箱；g)-70℃低温冰箱；h)磁力搅拌器；i)高压灭菌锅；j)可调微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）；k)RNase-free吸头（10μL、200μL、1000μL）；l)RNase-free离心管（1.5mL、2.0mL）；m)RNase-freePCR反应管。1.1　试剂所有

5、实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录A；除特殊说明外，均为符合GB/T6682，实验用水为无菌超纯水或去离子水。1.1.1　RNA提取试剂：a)多糖多酚植物RNA提取试剂盒或其他等效产品；b)三氯甲烷；c)异丙醇；d)75%乙醇；e)RNase-free超纯水。1.1.2　反转录试剂：a)随机引物；b)RNase抑制剂；c)逆转录酶：AMV或其他等效酶；d)dNTPs（10mM）；e)-20°C贮藏。1.1.3　PCR试剂：a)DNA聚合酶试剂盒：2×EsTaqMasterMix或其他等效产品；b)DNA分子量标记物：100bp～2000bp；

6、50×TAE缓冲液；c)核酸染料：Gelred（10000×）溶液或其他等效溶液；d)含10-4倍浓度Gelred的1%琼脂糖凝胶；e)6×DNA上样缓冲液。2　RT-PCR检测方法2.1　方法提要5DB37/T××××—××××芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒，利用TransZolPlant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。1.1　样品采集观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状，取出现上述症状的样品装至无菌样品袋中，标记样品编号

7、、取样时间、取样地点，于低温条件下（2℃～8℃）运送至实验室，放置-70℃超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的样品作为阴性对照，以确定感染DsMV或CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行同样处理。1.2　RNA的提取和纯化1.2.1　称取100mg样品置2ml离心管中，用液氮速冻后迅速研磨，然后加入1mL裂解缓冲溶液（1mL/100mg样品），剧烈振荡混匀，室温放置5min；4℃，13000rpm离心5min。1.2.2　取上清液于1.5mL离心管中，加等体积的缓冲液2，颠倒混匀后加入1/4体积三氯甲烷，再次颠

8、倒混匀，室温静置2min～3min。4℃，13000rpm离心10min。1.2