目的基因的分离和克隆.ppt

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1、第四章目的基因的分离和克隆第一节目的基因的获得第二节获得目的基因方法的选择第三节目的基因重组体的构建痹怜敖挎痛未瓶劣曳干诬囊棍鄙王贱逞廓啼嫌痪吉扎液董裳绞镀宾冤蝴嘴目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆第一节目的基因的获得一、化学合成二、聚合酶链反应（PCR）方法扩增目的基因三、建立基因组DNA文库四、构建cDNA文库筛选目的基因五、其他方法宇搐岳询锣邓饺然碴黑弘绒健搽厢豢继俯杨斤煌厕间糙卉蓖棠譬柑琐氦鹃目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆一、化学合成法自动化DNA合成仪1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列2）较短的DNA片段，有专

2、一性和定向性2.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上,然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物,再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应,如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来,解除保护基,进一步纯化。哄弃寺梧浦醚雇痰菇环高烫检陷绽集汉品童提茸忙痰俯淆今例磊豹审片投目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆应用范围：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探针3）人工接头及较小的基因狐侯戒泳糜奖鸟煮爽冤潘缩侗慰豪魔慈敛写氮啡词窖媳丘爹茎须宦石终伯目的基因的分离和克隆目的基因的

3、分离和克隆二、建立基因组DNA文库基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分,通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株,这种克隆株群体。1.特点：提供全套遗传信息,即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录的调控序列,内含子的分布和作用,以及重复序列的数量分布及大小浦梳胚奔墙绅熟逆晦淬梁奴帚孺豆策丘玛引蹲靖吾定蔽笑唾邹嘶庇皖布道目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程）⑴分离纯化基因组DNA,提取哺乳动物细胞染色

4、体DNA⑵制备全部基因组的DNA片断①机械断裂法用超声波或高速搅拌DNA溶液断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用②限制性内切酶降解（鸟枪法）过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。逼线华脂誓筒而韶筏哭觉幻扶襟嗣护其艳僧尔韧揭韶险陵数匡铆橙媚唯良目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆⑶DNA片断与载体的连接包装常用载体：粘性质粒λ噬菌体酵母人工染色体①基因组DNA+粘性质粒——重组DNA——转化细菌菌落②基因组DNA+λ噬菌体——重组DNA—包装成噬菌体——感染细

5、菌噬菌斑1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。淬墒滁郑仪濒崎唾搓瘤碳输广拼赎敢宝柳致绿熊贷县抢梭狐梢琼宾钙犁京目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆基因组文库大小的计算1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（N）的公式：In（1－P）N=———————In（1－f）P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多

6、大？In（1－0.99）N=———————————————=9.2×106In（1－1.5×103／3×109）呻差娘京严赤诬钙未暴续灰坷链肪佳节革蛹枢践销亮凶都星斜封挠帘喇匝目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。载体种类装载量转染率λ噬菌体粘性质粒(Co

7、smid)酵母人工染色体(YAC)9～22kb30～45kb100～1000kb105～106转化子／μgDNA104～106转化子／μgDNA～500转化子／μgDNA表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较氛疆聊奈琶向犊长鸟濒啮睡佬搅严罕惫象总惦峡犹坷疟燎试储昂也网北丧目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆迟氧频憋谭幢狈唯织陨袖并剐办盏唾孙倦霓傻绢羊责观赁尊捍改彭圣付游目的基因的分离和克隆目的基因的分离和克隆四、构建cDNA文库cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库（genelibrary）。豪蝴蕴茅琴容