目的基因克隆ppt课件.ppt

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1、第六章目的基因克隆主要内容第一节PCR扩增法获得目的基因第二节基因的合成第三节基因组DNA的克隆第四节cDNA文库构建及筛选第五节差异克隆技术第六节DNA诱变第七节转化、筛选与鉴定第一节PCR扩增法获得目的基因RT-PCR法RT-PCR的步骤三种不同引物引导的RT-PCR已知基因N端部分序列RT-PCR其它PCR法反向PCR锚定PCR连接介导的PCR盒式PCRRACE一、RT-PCR法RT-PCR的步骤反转录PCR扩增获得RNA模板反转录：将RNA反转录成cDNA第一链常用RNA模板常采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法提取的总RNA中只有少部分是mRNA，大部分为rRNA和tRNA

2、TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，含有苯酚、异硫氰酸胍等物质.细胞总RNA采用亲和层析法oligo(dT)纤维素柱分离纯化真核mRNAmRNA基因特异引物（genespecificprimer，GSP）多聚寡核苷酸引物（oligo(dT)primer）随机六核苷酸引物（randomhexamerprimer）三种引物扩增特异性高低反转录将RNA反转录成cDNA第一链反转录的引物：三种以合成的cDNA单链为模板，采用基因特异引物进行常规PCR扩增过程：PCR扩增上游引物与cDNA第一链退火，在DNA聚合酶的作用下合成cDNA第二链以cDNA第一链和第二链为模板，用上、下游引物进

3、行PCR扩增2.三种不同引物引导的RT-PCRRNA提取反转录PCR过程3.已知基因N端部分序列RT-PCR目的基因的DNA序列未知，但其编码蛋白的N端部分氨基酸序列已知根据氨基酸序列设计的简并引物和oligo（dT）进行RT-PCR简并引物根据密码子的简并性设计的针对编码每个氨基酸的所有碱基组合的混合物扩增对象扩增方法已知基因N端部分序列RT-PCR示意图获得的目的基因的DNA片段不完整，仅知道基因上一小段序列信息时——二、其他PCR法反向PCR锚定PCR连接介导的PCR盒式PCRRACE适用对象方法用于扩增已知目的基因序列侧翼的DNA片段1.反向PCR扩增对象操作过程酶切连接环

4、化PCR扩增测序分析反向PCR原理示意图RS:限制性内切酶酶切位点GSP:基因特异引物根据已知序列设计的基因特异引物2.锚定PCR扩增对象也称之为单侧特异引物PCR（SSP-PCR），是根据已知目的基因的一小段序列信息来快速扩增已知序列上游或下游片段的技术引物引物1引物2即锚定引物，根据序列的共同特征设计的非特异性引物，非特异性引物所起的作用是在其中一端附着。与锚定引物结合的序列称为锚定序列。方法扩增目的基因已知序列下游3’端未知序列oligo（dT）作为锚定引物扩增目的基因已知序列上游5’端未知序列用DNA末端转移酶，在cDNA3’末端加上Poly（dA）尾与此Poly（dA）相

5、对应的Poly（dT）作为锚定引物PCR具体过程包括两轮PCR扩增第一轮：采用不对称PCR高浓度的基因特异引物和低浓度的非特异性引物第二轮：以稀释后的第一轮PCR产物作为模板相同浓度的基因特异引物和非特异性引物进行扩增锚定PCR原理示意图在普通PCR过程中增加了连接的步骤，即通过连接反应加上去一个公共接头3.连接介导的PCR应用范围只知道DNA一端的序列又要对未知的一端进行测序对体内甲基化图谱或DNA印迹进行分析方法引物通过目的基因的已知序列设计的基因特异引物引物1引物2接头引物连接介导的PCR原理示意图4.盒式PCR方法在普通PCR过程中加入了一个Cassette（盒）人工合成的

6、带有限制性内切酶的粘性末端的双链DNA分子Cassette在设计时其5′末端没有磷酸基团目的DNA片段的3′末端和Cassette的5′末端的连接部位形成缺口在第一次PCR的第一个循环，从Cassette引物CP1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了引物CP1和引物CP1同一引物之间的扩增，减少了非特异性PCR扩增特点盒式PCR原理示意图CP:Cassette引物GSP:基因特异引物（正义引物）AGSP:基因特异引物（反义引物）5’端之间的未知序列5’RACE5.RACErapid-amplificationofcDNAends通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基

7、因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法过程和分类以mRNA为模板反转录成cDNA第一链用PCR扩增出cDNA内某一已知序列位点到其3’端之间的未知序列3’RACE锚定PCR被用于RACE技术，根据锚定序列引入方式的不同，RACE分为经典RACE和新RACE经典RACE：以锚定序列作为引物，3’RACE中在反转录时引入第一链cDNA，5’RACE中在合成第二链时引入第二链cDNA新RACE：锚定序列在反转录以前以寡聚核苷酸RNA的形式连入mRNA中经典3’R