流式细胞仪上机培训手册簿.doc

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1、实用文档流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1)取样。取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2)编号。根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a)1号管：相应同型对照；b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3)加样。用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4)洗涤。加入1mlPBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；5)染色。弃上清，加入100μlPBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量

2、保持在避光条件下进行。）6)洗涤。加入1mlPBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；7)重悬。弃上清，加入0.5mlPBS/管，混匀，上机检测(可选择BDFACSCantoII或BDAccuriC6)。（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。）8）试验结果分析。（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。参考值：CD3+60.8-75.4%CD4+29.4-45.8%CD8+18.2-32.8%NK（CD3-CD56+）9.5-23.5%实用文档二、上机检测BDFACSCantoII简要操作流程启动流式细胞仪1打开流式细胞仪电源2

3、启动计算机，打开软件登录3确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometer>connect检查液体水平1启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示。实用文档2如果液流车未自动开启，选择Cytometer>FluidicsStartup。3当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。检查气泡1在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。2如果没有看到气泡，进行第5步。如果看到气泡，点击Cytometer>CleaningModes>实用文档De-gasFlowCell.3当完成信息出现后，点击OK。4如果还可以看到气泡，重复上述操作。注意：如果

4、打开流动室细胞进口门时出现错误信息，通过关闭进口门，并等待30秒关闭该信息。5当您完成上述操作后，在往下进行之前请先检查激光预热是否已经完成。创建实验1按照需要，在工作区工具栏中点击相应的按钮来显示浏览器、细胞仪、检测器、工作表、获取控制板和双指数编辑器窗口。2创建文件夹：A在浏览器中选择数据库图标，并点击浏览器工具栏上的NewFolder。B对该文件夹命名。3选择该文件夹，点击NewExperriment来创建一个新实验。实用文档4对该实验进行重命名。5选择实验级别的细胞仪设置，然后点击Inspector(检测器)中的Parameters(参数)选项卡。6按照需要变更，添加或

5、者删除参数。运行样本并记录数据1将样品管安装到流式细胞仪中并点击AquireData(获取数据)。A把抽吸臂向左侧推。B把流式管放置到SIT上，确保试管竖直，并用力向上推试管直到试管完个停止并完个就位。C把抽吸臂放置到试管下的中心位置。抽吸臂上有3个传感器引脚。试管底部应定位在这些引脚的中心位置内。实用文档2调节FSC和SSC电压以正确显示细胞的散射光特征。3必要时，点击阈值图标并对FSC阈值进行调节。4调节P1门仅围绕目的细胞群体。5调节好后，点击RecordData(记录数据)以记录数据。6获取停止，取出试管。建立全局工作表1如果用户参数中启用了Defaultglobalw

6、orksheet(默认个局工作表)(默认选项)，则全局工作表已经存在。展开全局工作表文件夹来定位和重命名工作表。（注：如果Defaultglobalworksheet被禁用，则通过点击浏览器工具栏中的NewGlobalWorksheet(新个局工作表)按钮创建个局工作表。）2使用设计对话框定义参数标记并指定各个试管要记录的细胞颗粒数。标记会出现在点图轴上和所有的统计结果图中。A选择Experiment(实验)>ExperimentLayout(实验布局)。B在Labels(标签)选项卡中，为试管输入适当的标签。例如，在FITC域中输入CD3。使用Tab键移动到下一个域。3在该全

7、局工作表中，创建用预览数据的点图。例如:创建PerCP-Cy5.5对SSC,FITC对APC,FITC对PE,FITC对PE-Cy7和FITC对APC-Cy7点图。设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：PBMC样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在实用文档FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。关机1选择Cytometer(细胞仪)>FluidicsShutdown(液流关闭)，并遵循所有的提示。2关闭细胞仪电源。3退出B