基本实验技术.ppt

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1、基本实验技术陈妍2012-12-17内容提要一、基本实验技术和方法细胞培养MTT划痕修复westernblotsiRNA二、如何把实验做好（心得体会）一、基本实验技术和方法（一）细胞培养1培养细胞的特性培养细胞的生长方式贴附生长：贴附于支持物表面悬浮生长：于悬浮状态下即可生长游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）培养细胞生长的条件1细胞的营养需要（血清质量好坏是实验成败的关键）2细胞的生存环境温度:37℃O220%CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3

2、无污染4无毒2.四唑盐（MTT）比色法原理：（1）活细胞线粒体脱氢酶（2）可溶性的四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。预实验OD:0.8—1.2有效值（线性范围）吸光度与所含的formazan量成正比细胞点板量的确定（保证所测的con值在0.8-1.2之间）不同的细胞株不同不同的时间点不同每孔细胞量24h48h30000.40.550000.60.780000.80.91000011120001.11.1150001.21.2200001.31.4细胞计

3、数×104个/ml每孔点板100μl给药100μl操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；8000个细胞/孔，每孔培养基总量200微升（100+100），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（20微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（100微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570nM）。记录结果，绘制点板注意事项蛇行点板十字交叉给药方向点板方向直

4、接比较各组OD值计算抑制率，公式[（对照-本底）-（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.3.划痕修复实验（woundhealing）原理：肿瘤细胞运动特性之一：侧向迁移能力借鉴体外细胞至伤愈合模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后观察处理后细胞迁移的能力0h24hCon(10%血清)给药实验步骤1.细胞点板，具体数量因细胞不同而不同，并根据给药时间和条件来定。2.第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。3.用PBS洗细胞3次，去除划落的细胞，加入培养基。4.放入37

5、℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。实验要点划痕质量宽度笔直程度划痕后一定要清洗干净结果处理Part1Part24.Westernblot原理：经过电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体抗原抗体反应先分离后分析蛋白含量或者表达、存在形式的变化蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色实验步骤实验要点1.上样量蛋白KD数2.制胶：上层胶和下层胶的比例上层胶不能有碎胶泳道笔直3.加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象4.转膜：成功的

6、关键保证时间不同厚度的胶最好不要一起转5.合适一抗浓度低：没有条带或条带不清晰高：非特异性结合杂带6.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数月,但是反复冻融会使蛋白质降解5.siRNA原理dsRNA的剪切RISC的形成siRNA介导的RISC对mRNA的剪切作用RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）选择、设计、合成siRNA双链（5种）化学合成siRNA质粒表达siRNA转染siRNA到靶细胞瞬时表达——化学合成siRNA，质粒表达siRNA稳定表达——质粒表达siRNA分析检

7、测RNA干扰作用蛋白水平:WB/IF/FCmRNA水平:RT-PCR、northernblottingsiRNA基因沉默实验设计siRNA转染方法磷酸钙共沉淀DEAE-葡聚糖和polybrene电穿孔法机械法阳离子脂质体试剂阳离子聚合物病毒介导法DNAorsiRNA:highlyanionicandhydrophilicmacromoleculeNoionicinteraction++++++++++Cationicmacromolecule++++++CationicReage

8、ntMembrane:anionicandhydrophobic----------siRNA转染试剂Lipofectamine2000（Invitrogen）INTERFERin™（Polyplus）Oligofectamine（Invitrogen）HiPerFect（Qiagen）SiLentFect（BioRad）转染的检测蛋白水平检测:WB/IF/FCmRNA水平检测:RT-PCR、northernbl