高春-生化药物常用分析方法.ppt

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1、生化药物常用分析方法北京市药品检验所生化生检室高春1.生化药物概念2.生化药物的分类3.蛋白质的含量测定4.电泳法5.酶的测定1．生化药物的概念生化药物是运用生物化学的研究成果，把生物体产生的各种基本物质用于预防、诊断和治疗疾病的一大类药物。包括从动物、植物、微生物等生物体中提取分离的天然物质及部分化学合成产物。通常所说的生化药物是专指在生物体内起重要生理作用的生命基本物质。如：氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、维生素、激素、糖与脂类等一大类药物。2.生化药物的分类(1)按其来源分：生化药物按其来

2、源不同可分为植物生化药物、动物生化药物、微生物生化药物及合成生化药物。(2)按其化学性质及作用分：可分为氨基酸、多肽、蛋白质、核酸及其降解物、酶与辅酶、激素、维生素、糖、脂、有机酸等。3.蛋白质的含量测定3.1氨基酸及蛋白质的显色反应3.2凯氏定氮法3.3福林-酚试剂法3.4双缩脲法3.5紫外吸收法3.1．氨基酸及蛋白质的显色反应3.1.1茚三酮反应3.1.2双缩脲反应3.1.3与酚试剂的反应3.1.1茚三酮反应：蛋白质在pH5~7之间，与茚三酮丙酮溶液加热煮沸时即出现蓝紫色。此反应用于蛋白质的定性与定量。此反

3、应的灵敏度为1μg。凡具有氨基、能放出氨的化和物几乎都有此反应，故可用于多肽与蛋白质及氨基酸的定性与定量分析。3.1.2双缩脲反应：蛋白质溶液加入氢氧化钠溶液后，逐滴加入0.5%硫酸铜溶液，则出现紫色或紫红色。原理当脲（尿素）加热（约180℃），两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲，然后在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。肽键越多反应颜色越深。氨基酸无此反应。3.1.3与酚试剂的反应：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸能与

4、含有磷钨酸－磷鉬酸化合物的酚试剂起反应。在碱性条件下后者被还原成蓝色物质。颜色的深浅与蛋白质的量成正比，所以可作为蛋白质的比色测定方法。3.2．凯氏定氮法3.2.1原理3.2.2试剂和仪器3.2.3操作步骤3.2.4注意事项3.2．凯氏定氮法3.2.1原理每一种蛋白质都有其恒定的含氮量一般为15～17.6%，平均为16％，因此只要测得样品中的含氮量，就可以通过计算求得样品的蛋白质含量。定氮法的基本原理是将蛋白质用浓硫酸分解，并使其中的氮变成铵盐状态，再与浓碱作用，放出的氨被酸吸收，滴定剩余的酸，计算出含氮量。微

5、量凯氏定氮法最低可测出0.05毫克氮，相当于0.3毫克左右蛋白质。蛋白质含量＝蛋白质含氮量×100/16＝蛋白质含氮量×6.253.2.2.试剂和仪器1．微量定氮仪器装置全套：包括蒸汽发生器、冷凝蒸汽收集器、微量定氮蒸馏瓶、小型冷凝管。2．消化炉（电炉）3．浓硫酸4.氢氧化钠溶液（40%）5．消化剂：硫酸铜及硫酸钾按1:4（w/w）至1：5比例，研细充分混匀。6．标准0.010N盐酸和0.010N氢氧化钠溶液。7．指示剂0.1%甲基红乙醇溶液。8．2％硼酸吸收液3.2.3凯氏定氮法一般步骤消化蒸馏滴定返回3.2

6、.4.注意事项1．必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。2．消化初期瓶内物质碳化变黑，并产生泡沫，要特别注意控制火力，微火加热，不能让黑色物质上升到颈部，否则将严重影响样品的测定结果。当混合液停止冒泡，气体逸出也较均匀时，可适当加大火焰，使瓶内液体微沸而不致跳荡。硫酸溶液逐步从棕黑色变成澄清。由于消化液澄清并不说明消化一定完成，为保证反应充分完成，继续沸腾1小时。反应终了，溶液应呈淡蓝色或无色透明，若带有黄色表示消化末完全。如果蛋白质样品中含赖氨酸或组氨酸较多，则消化时间要延长1-2倍。3．消化完毕，

7、静置使冷，仔细加入少量蒸馏水，洗涤管壁。因实验室中空气往往含有极微量的氨，每次分析时都要另做空白对照，即一切处理与样品管相同，但不加蛋白质样品。4．蒸馏前要先蒸洗15分钟以上。5．小心加样，避免样品污染凯氏瓶口部和颈部。6．使用凯氏定氮仪时，开关甲、乙的掌握与实验成败很有关系，在加样时，开关甲一定要开启着，而且一定要使蒸汽发生后才能关闭，否则会发生样品倒吸现象。开关乙也要关闭及时，防止氨逸出。7．蒸馏时，保持火力稳定，否则易发生倒吸现象。8．氨气蒸馏时，为了使所有硫酸铵分解为氨，必须加入足量40%氢氧化钠，加入

8、时要水平缓慢，以免产生剧烈反应而导致瓶内酸液倒吸和氨的损失，碱加入后，有铜氨离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色。并有胶状沉淀产生，这是正常现象，反之，如果不变，说明碱液可能不够。9．如果测定的不是纯蛋白质，可能含有非蛋白氮，必须分别测定蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮的测定可以将样品制成均浆或抽提液，用三氯醋酸或钨酸等沉淀剂将蛋白质沉淀出来，按总氮法测定上清液的含氮量，便得