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1、Thl7细胞在小鼠H22原位肝癌模型中的效果观察分析肝细胞癌(hepatocellutarcarcinoma,HCC)是世界上最多见的五大恶性肿瘤之一，死亡率列前三位[1],我国是HCC多发国家。但FI前以手术为主的综合治疗方法疗效仍不理想，故近年来免疫治疗越来越受到重视。Thl7细胞是一种以分泌IL-17为主要特征的CD4+T细胞,孤核受体RORYT是其特异的转录因了。Thl7细胞首先是在EAE和CIA的研究屮被发现，现研究表明IL-17的表达和人类很多口身免疫性疾病有关，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎症性肠病等[2-4]o最近研究发现，在一些肿瘤患者或小鼠肿瘤模型的肿瘤标
2、木中Thl7细胞明显升高，但是关于Thl7和HCC的研究，国内鲜有见到相关的报道。故木研究通过建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，检测脾脏中Thl7细胞的比例、肿瘤微环境屮1L-17基因和RORYT基因的表达，为能进一步系统地研究Thl7细胞在肝癌免疫中的作用和机制打下良好的基础。1材料与方法1.1材料1.1.1动物：6〜8周龄SPF级雄性Balb/C小鼠,体重(20土2)g。30只小鼠随机分为肝癌模型组、生理盐水对照组、空口对照组，各10只进行实验。1.1.2肿瘤细胞株鼠源性H22腹水型肝癌细胞株。1.1.3抗体和试剂FITCRatAnti-MouseCD4、PERatAnti-M
3、ouseIL-17A购自美国BD公司;SYBRGreenSupermix购自美国Bio-rad,PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。1.2方法1.2.1小鼠原位肝癌模型的建立H22肝癌细胞注入Balb/C小鼠腹腔,后抽取癌性腹水调整细胞浓度备用。肝癌模型组：小鼠麻醉后，开腹克视下将0.01mL癌细胞悬液注入肝脏。生理盐水对照组：肝内注入0.01niL生理盐水。模型制作后第30天处死小鼠取肝脏肿瘤组织固定，常规HE染色，进行病理组织学诊断。1.2.2Thl7细胞流式检测①取肝癌模型组、生理盐水对照组、空口对照组脾脏，机械法分离细胞，红细胞裂解液去除红细胞。②获得的各组脾脏单个核
4、细胞按照免疫磁珠操作规程分选CD4+T细胞。③CD4+T细胞接种于24孔培养板，加入PMA,Ionomycin,Monensin,使其终浓度分别为125ng/mL,1ug/mL和1。6ug/mL,在37°C、5%二氧化碳的环境下培养4h。④取细胞悬液，先后加入CD3-PE-CY5,FITCRatanti-mouseCD4标记细胞表面抗原,PERatAnti-Mouse1L-17A胞内染色，设同型对照组。用FACSCalibur流式细胞仪检测,以CD4,IL-17A双阳性细胞占CD4+T细胞的百分比记录结果。1.2.3实时荧光定量PCR检测Trizol法提取各组总RNA,反转录合成c
5、DNA。1±SYBRGreenSupermix,forwardprimer,reverseprimer,cDNA等试剂建立一个10uL的反应体系(引物设计见表1),放入ABI高通量荧光定量PCR仪7900IIT进行反应，反应条件：开始50°C2min,95°C10min,接着95°C15s和60°C1niin共45个循环。最后根据待测基因和内参的循环数CT值，使用2-AACT方法进行相对定量结果分析。1.3统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料以均数土标准差(x±s)表示，多组间比较均采用单因素方差分析，P〈0.05为差异有统计学意义。2结果2.1小鼠原位肝癌模
6、型建立病理检查示肝癌组织止常肝小叶结构消失，瘤细胞异型性明显，大小、形态不核大、深染，肿瘤细胞排列紧密，与周围的肝组织分界较为明显，肿瘤组织坏死明显(图1)O2.2流式检测Thl7细胞的相对比例肝癌模型组脾脏Thl7细胞占CD4+T细胞的比例(1・79±0・45)%高于空白对照组脾脏(0.17±0,17)%和生理盐水对照组脾脏(0.20±0,09)%,差异有统计学意义(P<0.01),而空口对照组脾脏、生理盐水对照组脾脏之间Thl7细胞占CD4+T细胞的比例差异无统计学意义(P>0.05),见表2和图2。2.31L-17基因和RORyT基因表达检测结果2.3.1肝癌模型组肿瘤组织I
7、L-17mRNA的表达其水平(3.70土0.43)高于空白对照组肝脏组织(0.79±0.13),生理盐水对照组肝脏组织(0・84土0・39)和肝癌模型组癌旁远端组织(0.70±0.27),差异有统计学意义(P<0.01),而各对照组之间IL-17mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。2.3.2肝癌模型组肿瘤组织RORYTmRNA的表达水平其水平(14.63±4,28)高于空白对照组肝脏组织(7.63±0.64),生理盐水对照组肝脏组织(7.86±
