犬瘟热病毒SH株的分离鉴定及其感染性克隆的构建.pdf

《犬瘟热病毒SH株的分离鉴定及其感染性克隆的构建.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、，－，＞：？／‘可．二；－苗Ｉ－汝為ｉｉＴ叫４Ｊ屬卢Ｌ－；．子某霧；：．蠢：．一译一一．：心，為．．Ｔ一：．＇ｉ顯：＇Ｖ＇．．Ｓｒ＇．＇．；．ｉ—一－话齡ｉ‘．遲，ｒ１化黯患＾Ｌ－巧囊专端ｌ蒙，ｒＮＳ辣：為，．＇言；．’．璋＞；．＇．．．作攻調‘＞记：夸茄寮外．气．秦象占參事；ｖＶ．＞积：Ａ巧．怒Ｉ＇．夢Ｈ棘２－３名．＊禾的身Ｉ：＇输．矿：如ｖ葛：，？＾硕料研究生地ｔ业）故ｆ－Ｓ．，Ｖ‘咬逊、羣＾庶組馆鉴郎１毒＾朱的於＾菜芽＇－产＾卽构．感觀嘘克＾重ｔ款臂‘．若＇；＂；．Ｉ物；Ｖ＼－

2、ｉ皆．祭心．．為：脅古祿韓Ｉ．．．籌麵＊蠢ｒ，；曲減．ｐ脅．．Ｖ．＾．站业基綱医．学＇：Ｖ；苗作ｋ／．‘．研ｎｎ向新槽研－错．苗，、研生生李辨＇審‘．ｖ貧’指Ａ师府於臟織＾．，！；完銭间口ｉ年月．．．，單’ｆｒ．ｖ．．．．引护ｃ／．、：．私‘寶ｓ義耗；ｒ替＾．Ｎ－．窠扣／的／＾，ｉ爹，Ｋ＂Ａ兴，雌片．ｖ震．邮＾西杨安屯義：＞＂‘非．．賓％＇．－，＾藝Ａ武．读呀觀．島；：嚇竭．管－；我．．皆．：每：ｉ：．．；Ｖ乂＾；篇誦祭ｉ適為．片．：Classific

3、ationcode:S852.4+2Universitycode:10712UDC:577Postgraduatenumber:2013050618Confidentialitylevel:publicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2016IDENTIFICATIONANDINFECTIOUSCLONEOFCANINEDISTEMPERVIRUSSHSTRAINMajor:BasicVeterinaryMedicineResearchfield:ResearchandDevelopmento

4、fNewDrugsNameofPostgraduate:LiDandanAdviser:AssociatedProf.ZhangMiaotaoDateofsubmission:May2016YanglingShaanxiChina本研究由国家自然科学基金项目（31270194,31502068）中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助ThisstudywassupportedbytheChineseNaturalSciencesFoundation(31270194,31502068)theFundamentalResearchFundsfortheC

5、entralInstitutesprogram.犬瘟热病毒SH株的分离鉴定及感染性克隆构建摘要背景：犬瘟热（Caninedistemper，CD）是由犬瘟热病毒（Caninedistempervirus，CDV）感染引起的犬科及其他食肉目动物等多种动物的急性、高度接触性传染病。死亡率高达80%，对当前的养犬业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业产生了严重的危害。目前，我国CDV野生型毒株的反向遗传技术平台还不完善，限制着CDV在宿主动物体内扩散分布及其分子致病机制的研究。因此，构建CDV的感染性克隆以研究当前流行犬瘟热野毒株的特性具有重要的意义。方法：（1）

6、将自然感染的患病犬病料按照1:10比例研磨，过滤后接种稳定表达犬SLAM受体的BHK-SLAM细胞，于感染后48-60h收集细胞毒继续传代，传至第三代时对收集的细胞提取RNA，以RT-PCR方法检测病毒，同时测定病毒滴度。最终大量扩增病毒，以差速离心法纯化，使用电子显微镜鉴定病毒；（2）采用RT-PCR技术从自然感染的患病犬病料中克隆出CDV全基因组序列及其H基因序列，利用生物信息学技术对全基因组序列进行拼接并分析，扩增的H基因命名为CDV-H，拼接的全基因组序列命名为CDV-SH株；（3）采用PCR方法扩增CDVN基因，扩增正确的片段克隆至原核表达载体

7、pET-32a(+)中，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，IPTG诱导，表达重组N蛋白，并采用包涵体纯化的方法纯化重组蛋白。PCR扩增得到1572bp的N基因片段，用纯化的重组N蛋白免疫试验兔，制备N蛋白的多克隆抗体，用Westernblot检测其特异性；（4）根据CDV的全基因组序列设计特异性引物，将CDV-SH株的全基因组分8个节段逐段插入PSK（+）载体，构建pSK-CDV-SH重组质粒；同时构建并分别表达CDV-SH株N、P、L基因的真核重组表达质粒pCI-CDV-N、pCI-CDV-P、pCI-CDV-L。采用脂质体转染的方法将上述4种质粒共

8、转染BHK-SLAM细胞，培养72h后，收获细胞培养物，再盲传3代，用间接免疫荧