鸡传贫病毒安徽分离株感染性克隆的构建及其凋亡素抗体的制备

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1、分类号：Ｓ８５５．３单位代码：１０３６４：；１２７２胞４２密级学号复敏朵扯大ｆ学位论文鸡传贫病毒安徽分离株感染性克隆的构建及其调ｔ素抗体的制备ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＣｌｏｎｅｏｆａＣＩＡＶｉｒｕｓＳｔｒａｉｎＩｓｏｌａ化ｄ：ｆｒｏｍＡｎｈｕｉＰｒｏｖｉｎｃｅａ凸ｄＡｉｉｔ化ｏｄＰｒｅａｒａｔｉｏｎｏｆｙｐＡｐｏｐｔｉｎ研究生：陈海云指导教师：刘雪兰合作指导教师：申请学位类别；

2、农学硕±专业领域名称：预防兽睽学＊研究方向：兽医微牛物与免疫学所在学院：动物科巧学院／／答辩委员会主席；／ｊ二零一五年五月Ｉ独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方夕Ｆ，论义中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使巧过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示

3、了谢意。研究生签名；时陆在Ｇ年＾月务曰獻＾４关于论文使用授极的说明送本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留交论文的复印件和磁盎，允许论文被查阔和借阅，可拭采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可臥用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：三身＾时间：又〇於年月日杆＾一－剧礎第名；处时间；（２Ｗ年／月Ｋｉ摘要鸡传染性贫血病毒(Chick

4、enanemiavirus,CIAV)在世界主要养禽国家广泛分布，是危害养禽业的主要病原体之一。鸡是CIAV自然感染的唯一宿主，贫血、淋巴器官萎缩和免疫抑制等是CIAV引起的主要病变，常并发或继发其它病原体，造成经济损失。本研究首先从安徽省某养殖场分离鉴定一株CIAV，并在克隆该株病毒全基因组的基础上构建感染性克隆，表达其毒力因子凋亡素（Apoptin），为进一步研究CIAV致病机理和疫苗设计提供参考。首先，提取安徽某鸡场送检病鸡骨髓中DNA，通过自行设计的3对特异性引物以PCR方法分别扩增病毒3个基因，与

5、pMD18-T载体连接转化大肠杆菌，对阳性克隆进行测序检测。结果表明，病鸡感染了CIAV，将该毒株命名为CIAV-HF211株。通过对CIAV-HF211株与国内外8个分离株的关键结构蛋白VP1基因进行同源进化分析，结果发现基因序列同源性为95%-99.1%，氨基酸序列同源性为96.7%-99.6%，其中与天津分离株AY846844同源性最高。其次，通过设计1对引物（引入EcoRI和XholI），扩增出CIAV-HF211株全基因组插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建单拷贝pcD-CIAV。在此

6、基础上，通过另外1对引物扩增第二个全基因组序列并插入到病毒基因组自身携带的BamHI酶切位点处，构建2个CIAV基因组顺次连入一个载体的克隆，命名为pcD-2CIAV。通过腿肌注射1日龄SPF鸡pcD-2CIAV重组质粒（150μg/只），对照组分别注射PBS和病料研磨液，每组注射3-4只。在攻毒后第12d剖检，观察病变并进行病毒基因的检测。结果表明，与PBS对照组相比，pcD-2CIAV重组质粒与CIAV病料感染具有相似的病理变化，且PCR检测结果为阳性，表明了成功构建了1个CIAV感染性克隆。该结果为进

7、一步研究CIAV-HF211株的致病性及研制疫苗奠定了基础。最后，亚克隆CIAV-HF211分离株Apoptin基因，插入原核表达载体pET-32a（+）中，转化大肠杆菌Rosetta（DE3），对阳性菌株经0.2～1.0mmol/L的IPTG诱导不同时间后经SDS-PAGE电泳检测，并通过镍柱亲和层析纯化His-apoptin融合蛋白，免疫家兔，建立间接ELISA检测Apoptin融合蛋白的抗体水平。以Westernblot方法分析融合蛋白反应原性。结果表明，经1.0mmol/LIPTG诱导18h后可获得

8、较多可溶性表达的apoptin融合蛋白，分子量约为31.6kDa。第三次免疫后，Apoptin融合蛋白的抗血清效价达到1:1280000。Westernblot分析表明，该抗血清可与融合蛋白发生特异性反应。综上所述，本研究分离鉴定了来自安徽区域的1株CIAV，并成功构建了该株病I毒的感染性克隆，对其Apoptin基因进行了原核表达，建立了间接ELISA方法检测抗Apoptin抗体方法，为进一步研究CIAV致病机理