免疫学实验技术.ppt

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1、免疫学实验技术抗体定义：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。医学应用：科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。多抗来源动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形

2、成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中，即为多克隆抗体。多克隆抗体制备动物选择：兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guineapig）：国外实验室常用。基本步骤延长抗原的作用时

3、间增强吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细胞“极化”佐剂的作用机理：抗原制备：商品化或自行表达基础免疫：首次，抗原用量大，用佛式完全佐剂（ComplateFreund’adjuvand,含矿物油,卡介苗等)。加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用佛式不完全佐剂(IncomplateFreund’adjuvand,不含卡介苗).取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制备血清：可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)实验方法新西兰大耳白，2000g(雌雄均可),健康,无病

4、原基础免疫0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原)0.5ml佛式完全佐剂(CFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射加强免疫间隔2-4周,可进行多次0.5ml抗原(蛋白量减半)0.5ml佛式不完全佐剂(IFA)制备抗原-佐剂乳化液背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射实验方法免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价酶联法：1:104以上，能达到1:106。免疫双扩散：1:16以上，能达到1:64效价达到要求的可放血制备血清可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)多抗的特点多抗是单抗的混合物，因

5、此多抗的性质是一个群体综合的性质。比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。特异性相对较差：因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多。什么情况下需要制备单克隆抗体目的蛋白有结构类似物抗原不纯，无法分开多抗效果不好（已排除非特异性反应）希望将抗体用于治疗，研制成药品希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂单抗制备原理如果能选出一个制造一种专

6、一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其

7、结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。单抗制备原理HGRPT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶TK：胸腺嘧啶核苷激酶HAT：次黄嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A)基本步骤实验方法免疫小鼠选择体重18－20gBALB/C雌性小鼠，用制备抗原免疫。50—100ug抗原/只与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.5ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次皮下多点注射0.5ml每只，过3周后用

8、加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。细胞融合取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50%PEG（Sigma）作为融