免疫学实验2-----免疫荧光技术.ppt

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1、免疫学实验2-----免疫荧光技术实验目的初步掌握免疫荧光技术的原理、一般操作步骤及结果的观察方法Principle:antigen+antibodyTwonecessaryconditions:specificityvisibilityAg-Abcomplexantibodyasresearchanddiagnostictools一、原理免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）------将抗体（或抗原）经荧光素标记，然后再与相应的抗原（或抗体）结合，在一定波长光波的照射下，被标记的荧光素放出可见光（称为荧光），借助荧光显微镜或流式细胞仪可对待

2、测抗体或抗原进行定性和定量分析。一、原理目前用于免疫荧光分析的荧光素异硫氢酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC)四乙基罗达明（lissaminerhodamineB200,RB200)藻红蛋白（R-PE）由于这些荧光素经激发光照射后可发射出不同波长的荧光，因而可对细胞的一种或多种蛋白进行示踪。免疫荧光技术主要用于分析的标本有：外周血新鲜细胞、培养细胞、组织切片等直接法------将荧光素标记单抗后直接对抗原进行分析的方法标记抗体荧光方法间接法----将荧光素标记在第二抗体（抗抗体，通常为抗鼠IgG）的分析方法标记抗体荧光方法直接法间接法特异性

3、高、敏感性低特异性低敏感性高取待测细胞，调整细胞浓度到1×106/50l每管；加50lFITC标记的鼠抗人CD28单克隆抗体（1g），震荡使之充分混匀；同时设阴性对照管置于4℃孵育30分钟，每10分钟混匀；4.加入2mlPBS（含2%FCS）混匀洗涤，1500rpm/5min,4℃离心，弃上清；5.重复步骤4；6.加入0.5mlPBS重悬细胞实验内容——转基因细胞CD28膜分子的检测操作步骤（直接免疫荧光法）结果观察A：将细胞移入装有0.5ml测定液的流式测定管中，上流式细胞仪检测；B：取（5-10）l细胞于载玻片上,加盖玻片，压紧，置荧光显微镜观察，出现细胞膜荧光者

4、为阳性。单标记、双标记、多标记荧光素流式图思考题1、直接免疫荧光标记和间接免疫荧光标记的优缺点？2、如何减少免疫荧光检测中细胞非特异性荧光染色？