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1、实验三培养基的制备、灭菌及微生物的分离与纟q化实验三培养基的制备、灭菌及微生物的分离与纯化一、实验FI的1.了解配制培养基的一般方法和步骤；掌握牛肉膏蛋白腺培养基、高氏1号培养基和马丁埠养基的制备方法。2.了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。3.掌握严格的无菌操作技术，掌握从土壤屮分离微生物的方法。二、实验内容1.学习牛肉膏蛋白腺培养基、高氏1号培养基和马丁氏培养基的配制。2.学习高圧蒸气灭菌的操作方法。3.学习用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌；用平板划线方法分离微生物。4.学习斜而接种及穿刺接种等无菌操作技术。三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白
2、腺、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、lmol/LNaOH.lmol/LHClKNO3、NaCl>K2HPO4•3H20>MgSO4•7H20>FeSO4•7H20>4.5mL无菌水6管，10%酚液,49.5mL无$水（带玻璃珠）1瓶。土壤样品、试管、培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、称量纸、牛角匙、pH试纸、棉花、报纸、记号笔、线绳、纱布、酒清灯等。屯炉、立式高压蒸气灭菌锅、手提式高压蒸气灭菌锅、超净工作台等。四、操作步骤（一）培养基的制备1.牛肉膏蛋白腺培养基的配制牛肉膏蛋白豚培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培
3、养基。其配方如下：牛肉膏3g,蛋白月东10g,Nacl5g,琼脂15〜20g,水1000mL,PH7.4〜7.6（1）称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯屮。牛肉膏可放在小烧步屮称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白月东极易吸潮，故称量吋要迅速。（2）加热溶解：在烧杯屮加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻浪搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解白药品屮，再加热融化，此过程屮，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。（3）调pH：检测培养基的pH,若pH偏酸，
4、可滴加lmol/LNaOII,边加边搅拌，并随时用p试纸检测，直至达到所需pH范閘。若偏碱，则mlmol/LHC1进行调节。pH的调节通常放在加琼脂Z前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。（4）过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察但是供一般使用的培养基，这步可省略。（5）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免孫培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容无的一半为宜。半固体培养
5、基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。（6）加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大力和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉冬总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布fl成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。（7）包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌吋冷凝水沾湿总塞。若培养基分装于试管屮，则应以5支或7支在一起，冉于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。夂后用记号笔注明、培养基名称、组别、H期。
6、（8）灭菌：将丄述培养基于121.3°C湿热灭菌20mino如因特殊情况不能及时灭菌，则应故丿冰箱内暂存。（9）摆斜而：灭菌后，如制斜而，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，隹斜面的长度不超过试管总长的l/2o（10）无菌检查：将灭菌的培养基放入37°C温箱屮培养24〜48h,无菌生长即可使用，或贮彳于冰箱或清洁的橱内，备用。1.高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g,KNO3lg,NaCl0.5g,K2HPO4-3H200.5g,MgSO4-7H200.5g,FeSO4-7H
7、200.01g琼脂15〜20g,水lOOOmL,pII7.4〜7.6。（1）称量和溶解：先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯屮，并用少量冷才将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其彳I成分依次溶解。对微量成分FeSO；-71【20可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在lOOOmL'l加入lg的FeS04•7H20,配成浓度为0.Olg/mL的贮备液，再在lOOOmL培养基屮加入以上贮备液lm即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过无同牛肉膏蛋白腺
8、培养基配制。（2）pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白豚培养基配制。1.马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌
