流式细胞术原理和应用.ppt

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1、流式细胞术原理及应用一、什么是流式细胞术？流式细胞仪的构造二、怎样设计流式实验？三、流式实验中涉及到的关键步骤四、常见流式细胞术应用一、流式细胞术基本概念流式细胞术（FlowCytometry）是对于处在快速直线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选技术.研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等。对生物颗粒的物理参数及生物学特性进行定性和定量分析。流式细胞仪构造图流式细胞仪五大系统流动室与液流驱动系统激光光源及光束成形系统光学系统信号检测与分析系统细胞分选系统流动室与液流驱动系统InjectorTipFluorescencesign

2、alsFocusedlaserbeamSheathfluid流动室，430×180um,鞘液1.空气加压进样2.蠕动泵精确定量进样激光光源与光束成形系统1.氩离子气体激光器，22×66um2.固体激光器405nm,488nm,561nm,635nm光学系统透镜、滤光片、小孔；LP：long-passfilterSP：short-passfilterBP：band-passfilter460500540SP500LP500BP500/50信号检测与分析系统物理参数FSC：前向角散色光，代表细胞大小SSC：侧向角散色光，代表细胞颗粒度粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死

3、细胞和碎片实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后荧光信号细胞自发荧光特异荧光素标记激发的荧光信号荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管1）检测光子，转换成电信号2）将电信号等比例的放大荧光信号的面积、宽度和高度由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两

4、种方式。一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白含量对数测量：细胞膜表面抗原检测直方图（DistributionHistogram）横坐标：道数纵坐标：细胞数散点图（DotPlot）横坐标：某细胞参数相对含量纵坐标：该细胞另一参数含量等高线图（ContourPlot）细胞分选系统MACS®技术：MageticActivatedCellSorting免疫学+细胞生物学+磁力学电荷式分选超声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、离心管、培养板、载波片等

5、)二、荧光素荧光的概念：激发波长Excitationwavelength发射波长(荧光波长)Emissionwavelength＜激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光荧光素（FITC/PE/PerCP/APC等)抗体偶联荧光素；分子探针结合荧光素AnnexinV-FITC；荧光染料/荧光化合物PI、7-AAD等插入核酸链中；CFSE和蛋白质共价结合；荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧光。常用荧光素常用荧光染料PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸

6、双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于

7、活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。三、如何设计流式实验确定实验要检测的marker选择合适的荧光素标记的抗体选择合适的同型对照抗体细胞处理（全血，培养的细胞）染色（室温，20min）离心洗涤（全血裂红）上机检测准备工作：实验步骤：A、根据机器配置选择荧光素多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。FACSCalibur常

8、用四色搭配：FITC、P