禽源肠炎沙门氏菌PmrB基因突变介导粘菌素耐药机制研究.pdf

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1、学校代码：10564学号：2013202810分类号：S859.79密级：硕士学位论文禽源肠炎沙门氏菌PmrB基因突变介导粘菌素耐药机制研究胡立立指导教师：郭霄峰教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：陈金顶教授中国·广州2016年6月华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结

2、果由本人承担。作者签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：摘要禽源肠炎沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，可以通过食源性途径传染给人类。粘菌素（colistin）是一种常见的多肽类抗生素，目前是用于治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染最后的选择。耐粘菌素肠炎沙门氏菌的出现及传播给多重耐药革兰氏阴性菌的治疗带来了极大的威胁。有研究表明PmrA/PmrB二元调控系统对革兰氏阴性菌粘菌素耐药的产生起到重要的作用。本实验室成功诱导出耐粘菌素肠炎沙门氏菌，对其Pm

3、rA、PmrB基因进行测序，发现PmrB发生了不同于已有报道的突变，PmrA基因并无变化。本研究在此发现的基础上利用Red同源重组及I-SceІ酶构建相应的PmrB无痕突变菌株，研究突变前后菌株对粘菌素最小抑菌浓度（MIC），和粘菌素耐药相关基因表达量变化，有助于了解禽源肠炎沙门氏菌PmrA/PmrB突变对粘菌素耐药的机制。主要的研究内容及结果如下：利用粘菌素在2-12（32）菌株的基础上继续诱导耐药，获得2-12（512），利用高通量测序技术对2-12和2-12（512）菌株进行全基因组测序。2-12和2-12（512）全基因组测序后进行

4、同源分析得2-12有5个特有蛋白，2-12（512）有9个特有蛋白；单核苷酸多态性（SNP）分析得2-12（512）与2-12比较有30个SNP位点。在辅助质粒pKD46-rha-IS表达的Red同源重组系统及I-SceІ酶的作用下，利用基因突变重组片段197-cat-sacB、249-cat-sacB无痕且快速对肠炎沙门氏菌PmrB基因进行突变，成功获得了沙门氏菌PmrB基因突变株。测定构建的PmrB基因缺失及点突变菌株对多种抗菌药物（包括粘菌素）的MIC值，结果表明，突变后菌株对粘菌素的MIC值均为16μg/mL，是2-12敏感菌株粘菌

5、素MIC的8倍。2-12ΔPIA与敏感菌相比对十二种常见抗生素敏感性无明显变化；2-12D149N和2-12相比，庆大霉素（GM）MIC值提高160倍，大观霉素（SPT）MIC值降低64倍，其余抗生素无明显变化。通过实时荧光定量PCR反应，测定肠炎沙门氏菌2-12、2-12ΔPIA、2-12D149N、2-12（32）、2-12（512）、GD1-13、GD1-14与粘菌素耐药相关的基因PmrA、PmrB、PmrC、PmrE、PmrH在mRNA水平上的表达量。结果显示PmrB突变显著的促进了PmrA、PmrB、PmrC、PmrE、PmrH基

6、因的表达。关键词：肠炎沙门氏菌；禽；PmrA/PmrB；同源重组；粘菌素IReseachonthemechanismofColistinresistancebyPmrBmutationsinSalmonellaentericafrompoultryHuLili(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China)Abstract：Salmonellaentericaisanimportantzoonoticagentandals

7、oafoodbornepathogenicbacterium.Colistinisoneofpolycationicantimicrobialpeptidesandcurrentlyregardedasthelast-resortantibioticforthetreatmentofmultidrug-resistantGram-negativebacterialinfections.TheemergenceandspreadofColistin-resistantSalmonellaentericaisagreatthreattomult

8、idrug-resistantGram-negativebacterialinfections.StudiesshowedthatPmrA/PmrBtwo-componentre