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1、微生物限度检验方法验证方案1•适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。2•目的通过验证确认所采用的方法适合于该纱品的微生物限度的测定。3.职责项H责任人：负责验证方案的起草及具体实施。验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。QA现场监控员：负责验证实施过程屮的监督检查，取样，确保结果的可靠性。QC负责人：负责验证方案屮检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。4.内容4」.概
2、述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该纱品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查吋，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。•验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母
3、菌计数同吋进行。421.验证用菌株及菌种要求大肠埃希菌[CMCC(B)44102】、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003】、枯草芽他杆菌[CMCC(B)63501】、黑曲霉【CMCC(F)98003]>白色念珠菌【CMCC(F)98001】。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽他杆菌为产芽他杆菌,前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存屮心获得的冷冻干燥菌种为0代),并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌
4、株的生物学特性。421.验证菌菌液制备4.2.2.1.人肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌菌液制备：接种人肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽泡杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基屮，35〜37°C培养18〜24小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递増稀释法，稀释至10<107,制成每lml含菌数50〜lOOcfu的菌悬液。4222白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基屮，23〜28°C培养24〜48小时；取此培养液lml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法,稀释
5、至10-6-10'7,制成每lml含菌数50〜1OOcfu的菌悬液。4223接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基屮，23〜2VC培养5〜7天，加入3〜5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将抱子洗脱，吸至无菌试管内，取lml加（）.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法，稀释至10^l（y6,制成每lml含抱子数50〜lOOcfu的抱子悬液。4.2.3.供试液的制备423丄无抑菌活性的供试甜供试液的制备♦稀释剂：pH7.0无菌氯化钠■蛋白月东缓冲液♦液体供试品:供试品10ml置锥形瓶中,加入90ml稀释剂,混匀,作为供试液（1：1
6、0）。♦固体、半固体、粘稠性供试品供试品：称取供试甜10g置锥形瓶屮，加稀释剂至100ml,混匀后，作为供试液（1：10）。4232具有抑菌活性的供试品供试液的制备当供试甜具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：♦培养基稀释法：取供试液2ml,每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注-1111；或取供试液lml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数,混匀，凝固，培养。每lml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为lml的菌落数。计算每lml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制
7、菌检查时可加人增菌液的用量。♦离心沉淀集菌法：取一•定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml,加稀释液补至原量。♦薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定具菌落数。♦屮和法：选取适宜的屮和剂如磺胺类药物加入适肖的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入疏基化合物如硫乙醇酸钠■半胱氨酸，洗必泰制剂加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%）,卤素屮加入硫代硫酸钠（0.1%）等方法或联合使用这些方法消除供试甜
8、的抑菌活性后测定。4.2.4.菌液组测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50〜lOOcfu）分别注入平lllfp,立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，
