基因工程原理-第章外源目基因表达与调控.ppt

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1、DNA重组（限制性内切酶）运输工具——基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达基因工程的应用目的基因载体受体细胞外源基因表达DNA重组载体第六章外源目的基因表达与调控第一节外源基因表达机制DNA转录翻译ATCGAUCG43=64遗传密码氨基酸折叠密码RNA蛋白质。转录过程启动子和调控序列——转录的关键原核生物启动子：lac、trp、λPR、λPl等一、外源基因的起始转录二、外源基因mRNA的有效翻译起始密码子：AUG是首选核糖体结合位点SD序列AGGAGG：至少包含4个碱基SD与AUG之间距离为3-9个碱基翻译起

2、始区不应形成二级结构真核细胞无SD序列，但大多含共同序列：5’-CCA(G)CCAUGG-3’（1）氨基酸活化和肽链的起始：AA+tRNA+ATP——AA-tRNA+AMP+PPi（2）肽链的起始：原核生物：30S+mRNA——+AA-tRNA——+50S真核生物：40S+AA-tRNA——+mRNA——+60S（3）肽链的延伸：肽基转移酶（4）肽链的终止：终止密码子(UAA、UAG、UGA)和终止因子（5）折叠和加工翻译过程氨酰tRNAaa＋tRNA+ATPaa-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRAN合成酶氨基酸的活化B：延伸C：

3、终止DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。一、启动子（promoter)：第二节基因表达的调控元件特征：序列特异性：不同启动子对RNA聚合酶亲和力不同方向性：5‘→3’位置特异性：位于调控基因的上游种属特异性：亲缘越近通用的可能性越大转录起始点：通常是一个嘌呤(A或G)Pribnow框，又叫-10区：TATAATSextama框，又叫-35区：TTGACA间隔区（一）原核生物的启动子典型的原核启动子有四大要素：TATAATTATAATTTGACAA/GTTG

4、ACAA/GPribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列SextamaboxrRNA基因启动子（Ⅰ型）：rRNAmRNA基因启动子（Ⅱ型）：mRNA、部分核内小分子RNA（snRNA）tRNA基因启动子（Ⅲ型）：5SrRNA、tRNA、snRNA（二）真核生物的启动子rRNA基因启动子（Ⅰ型）核心启动子（corepromoter）（-45—+20位核苷酸）上游调控元件（-170—-107位序列）（增强转录效率）（单独存在即可起始转录）mRNA基因启动子（Ⅱ型）没有广泛的同源性多数含TATA序列,通常处于-30区无TATA盒的

5、启动子称无TATA盒启动子tRNA基因启动子（Ⅲ型）真核和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNApol结合。转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合。二、增强子(enhancer)：增强基因启动子工作效率的顺式作用序

6、列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。特性：双向性重复序列功能与位置无关组织特异性可调控同源基因和异源基因结构基因的增强子1.增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍。经人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍!2.增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5'→3'或3'→5'），甚至和基因相距3kp，或在基因下游，均表现出增强效应；3.大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TG

7、GA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的；4.增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5.没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；6.许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。细胞专一性增强子：许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能。诱导性增强子：这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与。例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类

8、固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平。三、沉默子(silencer)是真核基因中的一种特殊的序列，与增强子有许多类似之处。沉默子能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性。四、绝缘子（