外源目的基因表达与调控.ppt

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1、第四节目的基因表达产物检测与分离纯化一、外源目的基因表达产物的检测外源目的基因的表达包括转录和翻译两个阶段。外源基因表达产物的检测过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。特异性mRNA的检测:Northern杂交特异性蛋白质的检测:ELISA,Western杂交1.Northern印迹杂交(Northernblot)检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的区别靶核酸：RNARNA电泳:在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基

2、汞变性电泳。转膜：不需变性2.ELISA1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA）。ELISA原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶

3、催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关ELISA原理图YY①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）ELISA可以分为直接法、间接法和夹心法等几种。直接法：直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。见图a间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合物后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结

4、合情况，进而计算出抗原或抗体的量。见图b夹心法：是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物，见图C。前者称为直接夹心法，后者称为间接夹心法。ELISA基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色E

5、LISA基本的实验过程3.WesternBlot要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是WesternBlot。Westernblot是生物学、生物化学、分子生物学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。Westernblot整个过程主要包括：PAGE电泳、转膜及蛋白检测3个阶段。聚丙烯酰胺凝胶的组成及特点组成：主要由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-甲叉(亚甲基)双丙烯酰胺(Bis)聚合而成。聚合：单独或混合时稳定，出现自由基团时会聚合。化学法的引发剂：过硫酸铵（APSorAP)，催化剂：四甲基乙

6、二胺（TEMED)特点：凝胶浓度越大，交联度越大，凝胶孔径越小。故根据分离蛋白质的大小选择不同浓度的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的原理聚丙烯酰胺凝胶的特点优点：聚丙烯酰胺凝胶电泳具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、用样量少(1～100μg)和分辨率高等优点。用途：蛋白质，核酸等物质的分离、定性和定量分析。WesternBlot基本原理经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载

7、体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测特定蛋白质的表达情况。Westernblot基本原理Figure1A.Inthedirectdetectionmethod,labeledprimaryantibodybindstoantigenonthemembraneandreactswithsubstrate,creatingadetectablesignal.1B.Intheindirectdetectionmethod,unlabeledprimaryan

8、tibodybindstotheantigen.Then,alabeledsecondaryantibodybindstotheprimaryantibodyandreactswiththesubstrate.A.DirectDete