资源描述：
《HIV病毒检测方法及其检测试剂盒.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、(54)发明名称HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒(57)摘要本发明公开了一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是根据GenBank公布的HIV病毒序列的保守区域设计HIVRT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;采用本发明人配制的RNA提取试剂提取HIV病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测
2、时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。1.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括如下步骤:（HIV病毒）RNA的提取:(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500uL裂解液匀浆，离心;(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合;(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;(4)用RNasefreewater洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;(5)配制预反应液，所述预反应液体积为15-20uL，包括:1.5-2.0mmol/L引物HIV-FI
3、P,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol/L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%TritonX-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I.dNTP,1-3U逆转录酶AMV,5-15UBstDNA聚合酶大片段引物HIV-FIP序列见SEQIDN0
4、:1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:5(6)在16-25uL预反应液中加入4-10uL步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25uL然后在温度为60-65°C，反应15-65min；LFD试纸检测:(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10uL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上60-100uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。2.根据
5、权利要求1所述的(HIVRT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7.6的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L.EDTA.3.根据权利要求1所述的(HIVRT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。4.根据权利要求1所述的(HIVRT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于
6、:所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。5.根据权利要求1或2或3或4所述的(HIVRT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针MIV-FITC-PROBE为5'端FITC标记探针:6.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT-LAMP扩增反应液，16-20uL的RT-LAMP扩增反应液包括:1.5-2.0mmol/L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/
7、L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol/L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%TritonX-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I.dNTP,1-3U逆转录酶AMV,5-15UBstDNA聚合酶大片段，其余为RNasefireewater.引物HIV-FIP序列见S
8、EQIDN0:1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:4，探针HIV-FITC-PROBE
