KLD-12多肽TGF-β1诱导MSCs向髓核样细胞分化的实验研究.pdf

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1、KLD-12多肽/TGF-β1诱导MSCs向髓核样细胞转化的实验研究KLD-12多肽/TGF-β1诱导MSCs向髓核样细胞转化的实验研究分类号：R687.3密级：学号：2012109087单位代码：10759石河子大学硕士学位论文KLD-12多肽/TGF-β1诱导MSCs向髓核样细胞分化的实验研究学位申请人卞正君指导教师孙建华副教授申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称外科学研究方向脊柱外科所在学院医学院中国·新疆·石河子2015年5月Experimentalstudysonthedifferentiationofbonemesenchymalstemcellsintonucleuspul

2、posus-likecellsinducedbyKLD-12polypeptide/transforminggrowthfactor-β1ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByBianZheng-jun×××(SpineSurgery)DissertationSupervisor：Prof.SunJian-hua×××May,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论

3、文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。中文摘要目的：利用KLD-12多肽药物缓释的特性，复合转化生长因子-β1（TG

4、F-β1），筛选合适的复合浓度与比例，构建椎间盘组织工程支架材料KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶，探讨KLD-12多肽/TGF-β1纳米纤维凝胶诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向髓核样细胞分化的生物活性。方法：采用不同浓度的TGF-β1与KLD-12多肽复合，Elisa法检测TGF-β1的缓释量。密度梯度离心法分离MSCs，分别采用KLD-12多肽TGF-β1纳米纤维凝胶三维培养（实验组）和KLD-12多肽培养（对照组），诱导MSCs向髓核样细胞特性方向分化。利用阿尔新蓝法（Alcianblue）、实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）、免疫组化染色等方法测定其向髓核样

5、细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质(extracellularmatrixc,ECM)聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、葡糖胺聚糖(Glycosalninoglycan,GAG)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)表达的情况。结果：(1)倒置显微镜下观察，体外培养的MSCs贴壁生长，呈长梭形。(2)Elisa结果显示，KLD-12多肽/TGF-β1凝胶可缓释出TGF-β1，并呈现先快后慢的趋势。随着时间的延长，凝胶释放的TGF-β1含量逐渐减少。(3)细胞增殖实验结果表明，实验组与对照组细胞数随着培养时间的延长而增加，且实验组增殖速度要高于对照组。(4)Calcein-AM/PI荧光染色显

6、示，凝胶内细胞生长良好，大量活细胞存在，维持圆形的细胞形态，凝胶边缘细胞呈梭形及纺锤形，部分细胞出现增殖。(5)细胞存活率显示，第14d，实验组存活率为89.14±2.468％，对照组存活率为87.53±4.201％，两组间差异无统计学意义（P>0.05）。(6)GAG检测结果显示，实验组与对照组细胞液中GAG含量都随着时间的增加而呈非直线型增加。第4、7d实验组GAG含量表达要高于对照组（P<0.05）；第10、14d，实验组GAG含量表达远高于对照组（P<0.01）。(7)Real-timePCR结果证实，实验组CollagenⅡ和AggrecanmRNA表达水平较对照组高，两组间差异

7、有统计学意义（P<0.05）。(8)实验组CollagenⅡ免疫组织化学染色阳性，表达量较对照组高。结论：KLD-12多肽TGF-β1纳米纤维凝胶诱导的MSCs可向髓核样细胞分化，髓核样细胞特异性细胞外基质GAG、CollagenⅡ和Aggrecan表达明显增高，为进一步研究应用KLD-12多肽TGF-β1/MSCs移植治疗椎间盘退行性变奠定了基础。关键词：KLD-12多肽；转化生长因子-β1；间充质干细胞；髓核样细胞；