细胞培养试剂及操作流程.doc

《细胞培养试剂及操作流程.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS1640培养液。2、10%FBSDMEF/12培养液。3、10%FBSDMEM/HighGlucose培养液。4、PBS：商品化的粉末，一袋溶于2L去离子水中，高压后4℃保存。5、胰酶6、冻存液：10%DMSO、>10%FBS，其余成分为16407、真核抗生素：G418:50mg/mlMDA-MB-231800ug/ml药筛浓度MCF-7800ug/mlSK-BR3100ug/mlT47D400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin）:10mg/mL、药筛浓度MCF-74ug/mlT47D1ug/mlMD

2、A-MB-2315ug/ml潮霉素（HygromycinB）:50mg/mL药筛浓度T47D200ug/mlMDA-MB-231800ug/mlMCF-750ug/ml8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml，使用浓度5ug/ml）9、细胞因子：IL-6、EGF（10ug/ml）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速

3、溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml离心管内。（3）将离心管以1000rpm转速离心5min。（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管实验流程：（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。（2）加入适量胰酶（一般25cm2培养瓶加0.5ml，10cm

4、dish加1ml），并且晃动几下使胰酶在平底分布均匀，放入37℃培养箱孵育。（3）适当时间后（231、SK-BR3用1min，MCF-7、T47D用2min，依据细胞不同时间不同）将培养瓶从培养箱拿出来，显微镜下观察细胞形态变圆、粘附性变弱后加入培养液终止酶反应。（4）用培养液冲洗瓶底，然后吹打细胞悬液使其均匀单个分布。（5）将悬液1000r离心5min后重悬，安装实际需要将悬液平分到培养瓶内，一般按1:3传代较好。3、细胞冻存准备：培养液、胰酶、15ml离心管、滴管、冻存管、冻存盒试验流程：（1）将已经长满的细胞取出，弃去培养液后加入适量胰酶，放入3

5、7℃孵育适当时间后，观察细胞变化。（2）用培养液终止反应后，吹匀，将悬液转移到15ml离心管内。（3）以1000r的速度离心5min（4）弃去上清，加入1-1.5ml冻存液，重悬，加入冻存管内（冻存管注意做好标记）。（5）将冻存管放入冻存盒内。盖好，放入-80℃冰箱冻存。4、细胞计数准备：胰酶、培养液、滴管、15ml离心管、计数板、移液器实验流程：（1）取对数生长期细胞，用适量胰酶消化后，1000r离心5min，重悬。（2）用微量移液器取10μL悬液，沿计数板一侧缓慢加入，确保悬液均匀充满计数池。（3）显微镜下计数四角大方格内的细胞数目，求平均值。（4

6、）根据公式n=四角大方格内细胞数/4*104（个）/ml