细胞培养技术 教学课件 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分7动物细胞的传代培养.ppt

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1、实验七动物细胞的传代培养一、实验目的掌握动物细胞培养传代的基本方法和操作过程。二、实验原理当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。三、器材超净工作台二氧化碳培养箱普通显微镜倒置显微镜酒精灯吸管培养瓶烧杯离心管离心机镊子（圆头）血球记数板四、试剂和材料Hanks液75％酒精0.25％胰蛋白酶DMEM培养液(含小牛血清及青、链霉素)五、操作1、吸去或倾出旧的细胞培养液(对

2、于小口的培养瓶可采用倾倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)。2、吸取适量的Hanks液加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去，重复一次,以清除血清成分,利于胰酶消化。3、加入适量0.25%胰蛋白酶（一般0.1～0.2mL/cm2，以消化液能覆盖整个瓶底为准）转动培养瓶，使其湿润整个细胞层，37℃下消化2-3分钟。翻转培养瓶,肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可吸除消化液(细胞的解离程度也可以通过倒置显微镜直接观察判断，一般以细胞突起缩回，细胞之间间隙增大，细胞缩成圆形等为准)。如消化程度不够，可延长消化时间；如见大量细胞片状脱

3、落，表明已消化过头，则不能吸除消化液而直接进行下一步操作。4、加入适量培养液终止消化5、吸取瓶中培养液反复吹打瓶皿底壁上的细胞层，至全部冲下，轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，取样计数，调整细胞密度为5×104/ml。15cm培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好，置37℃孵箱中培养。6、观察：细胞传代后，应每日对细胞进行观察，注意是否污染及细胞贴壁和生长情况。六、注意事项1、吹打过程需有序进行，即从一边开始到另一边结束，注意边角处。2、吹打时动作不宜过猛。七、结果与讨论1．利用倒置显微镜，绘制出传代细胞生长

4、图。2．讨论影响本次实验能否成功的主要因素