细胞培养技术 教学课件 作者 兰容 周珍辉 主编 章静波 主审 实验部分4动物细胞培养用液的配制和无菌处理.ppt

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1、实验四动物细胞培养用液的配制和无菌处理一、实验目的1．掌握配制细胞基础培养液（RPMI-1640、DMEM等）的方法和操作要求。2．掌握抗菌素、消化液及Hanks液的配制方法。3．进一步学习无菌操作，练习各实验器材的使用方法。4．练习细胞用液分装方法。二、实验用品试管架、记号笔、圆头镊、广口瓶火柴、1000mL烧杯、不锈钢正压滤器针头滤器、大、小滤膜、一次性注射器玻璃注射器三、操作（一）Hanks液的配制配方：甲液：NaHPO4·2H2O0.06克KH2PO40.06克MgSO4·7H2O0.20克葡萄糖1.00克NaCl8.00克三

2、蒸水750毫升乙液：CaCl20.14克三蒸水100毫升配制程序：1、将乙液徐徐加入甲液中。2、将0.35克NaHCO3溶解在37℃100毫升三蒸水中。3、用数滴NaHCO3液溶解0.01克酚红。4、将2、3液逐滴、搅拌加入到1液中。5、用三蒸水定容至1000毫升，充分混匀，4℃冰箱过夜。6、滤过消毒，小瓶分装，冷藏。配制注意事项：配制时各种药品要依次溶解含Ca2+和Mg2＋的物质因容易出现沉淀，配制时要单独溶解，然后在不断搅拌下加入。（二）血清的灭活处理1、选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。2、对照瓶内放入与血清等体积的水。3、对照瓶

3、内插入准确的温度计，放入水浴锅中，接通电源，调节温度控制钮，使温度计温度保持在56℃。4、血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴锅中，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30min。5、大瓶血清灭活后，进行分装。6、分装后，抽样做无菌试验，－20℃～－70℃保存。（三）0.25％胰蛋白酶的配制1、称取0.25克酶粉，用少量已消毒的D-Hanks液将胰蛋白酶粉调成糊状。2、加适量已消毒的D-Hanks液，磁力搅拌3～5天即可溶解（室温和4℃间断进行，室温高于30℃要减少酶液在室温中的搅拌时间），溶解完全后定容至100mL。3、溶解后的酶液

4、（深红色）滤过除菌，分装，－20℃冻存。（四）RPMI-1640的配制1、溶解培养基：将干粉培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中。振荡或超声助溶，一般不要加热助溶。2、补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3（2.0g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。3、加抗生素：一般抗生素终浓度为――青霉素100U/ml，链霉素100U/ml。市售青霉素为80万U／瓶，可溶于4ml体积，每一升培养液中加0.5ml即可。市售链霉素为100万U／瓶，可溶于5ml体积，每一升培养液中也加0.5ml即可

5、。（四）RPMI-1640的配制4、调pH值：加水到900ml（在需要加10％小牛血清的情况下），然后用5％NaHCO3调节pH到7.2，加水定容到终体积(必要时用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠调节pH)。5、过滤除菌：宜采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（100或200ml）。6、加小牛血清：根据培养基配制的量将小牛血清分装，冷冻保存（－20℃）。临用前加入小牛血清(10%~20%)。四、注意事项1、新鲜三蒸水应贮存与

6、棕色磨口试剂瓶中，三蒸水存放时间不要超过两周，最好现制现用。2、培养液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37℃温箱内置24～48hr，以检测培养液是否有污染。3、每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分损失或者污染。实验安排第一组：1）Hanks液的配制和分装：分装在100mL的培养瓶中，每瓶50mL，剩余的装在盐水瓶中。2）值日：领取DMEM培养基、Hepes、青霉素、链霉素、5mL一次性注射器10～15根；蒸三蒸水。第二组：1）Hanks液的配制和分装：同上。2）10月19号（下星期三）完成CO2培养箱和无菌室的

7、消毒工作；解冻分装好的小牛血清；培养瓶的灭菌工作。实验安排第三组：胰蛋白酶液的配制和分装：分装在25mL的培养瓶中，每瓶15mL，剩余的装在小盐水瓶中。第四组：1）小牛血清的灭活和分装：分装在25mL的培养瓶中，每瓶12.5mL，剩余的仍装在小牛血清瓶中。2）准备酒精棉。第五组：培养液的配制和分装：分装在100mL的培养瓶中，每瓶50mL，剩余的装在盐水瓶中。每组再清洗、包装和灭菌4个培养瓶。注意：用完的器皿要及时浸泡和清洗