质粒试剂盒提质粒步骤.doc

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1、操作步骤*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入45ml无水乙醇!*将RNaseA全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。1取1.5-4.5毫升过夜培养的菌液，9000rpm，离心30秒，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。处理超过1.5毫升菌液可以离心去上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。2用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3加250ul的溶液P2，温和的上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮

2、。温和的混匀，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。4加400ul溶液P3，立即温和的上下翻转6-10次，室温放置5分钟。室温13，000rpm离心10分钟，小心取上清。5将吸附柱安置于收集管上，加入500ul溶液P4，室温13，000rpm离心1分钟，弃滤液；将上一步所得上清液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13，000rpm离心1分钟，弃滤液。6加入500ul去蛋白液PE，13，000rpm离心30-60秒，弃滤液。此步骤为了

3、去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可忽略此步骤。7加入500ul漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），13，000rpm离心30-60秒，弃滤液。8重复步骤7一次，13，000rpm离心30-60秒，弃滤液。空柱13.000rpm离心2分钟。室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。9取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60-100ul洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65℃-70℃

4、水浴中加热效果更好），室温放置1分钟，13，000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小不应少于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。