培养细胞的观察和检测方法.ppt

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1、WELCOME培养细胞的观察检测方法生物技术教研室李延兰活细胞的观察检测方法培养细胞常用的染色方法细胞生长状况有关指标的检测方法细胞生物活性的有关化学检测方法电子显微镜技术一、活细胞的观察检测方法肉眼观察相差显微镜观察细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。细胞常规检查的方法为：肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。pH颜色透明度正常7.2～7.4桃红色清亮、透明酸性产物↓↓变浅、变黄污染混浊变黄←pH↓↓pH↑↑→变红大多数细胞适于在pH7.2～

2、7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。若培养瓶、瓶塞漏气，使CO2溢出，或者由于洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，致使细胞难以生长，甚至死亡。玻璃器材常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心

3、管。首次使用：重复使用的处理步骤：自来水刷洗0.1％稀盐酸浸泡过夜自来水冲洗自来水刷洗硫酸－重铬酸钾浸泡过夜自来水冲洗10次双蒸水冲洗2次单蒸水冲洗3次晾干、包装121℃高压蒸汽灭菌20min显微镜观察相差显微镜（phasecontrastmicroscope）活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。20世纪30年代荷兰Zernike原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。相差显微镜观察活细胞的步骤如下：调整好

4、相差显微镜观察瓶皿准备调光调焦与摄影细胞观察生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。显微镜观察细胞的生长状态BMSCs培养细胞的生长过程各种细胞及各代细胞增殖的时间不尽相同。原代细胞、成体组织的潜伏期较长，24h后仅见到部分细胞开始贴壁，9～12d长满瓶底，细胞融合呈交叉重叠生长。传代细胞系、胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、

5、对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80％就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。Anip973注意事项标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净。天气较冷时，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。对原代细胞培养进行相差显微照相，应在换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度

6、。观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈震荡；观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。显微镜观察活细胞的观察检测方法暗视野显微镜技术观察活细胞缩时显微镜摄影观察体外活细胞染色观察暗视野显微镜技术观察活细胞（darkfieldmicroscope)原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。缩时显微摄影术观察（time-lapsecinemicrophotagraphy，TLCM）优点：可直接记录活细

7、胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。缺点：较昂贵体外活细胞染色观察体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。碱性染料酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）活体染料噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胺蓝）恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）丫嗪类（中性红、詹纳斯绿）三酚苯甲烷类（甲基紫、维