DB22∕T 2704-2017 牛卵形巴贝斯虫病检测方法 PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：56317-2017DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—2017牛卵形巴贝斯虫病检测方法PCR法PCRassayfordetectionofbovineBabesiaovata本标准仅供内部使用不得翻印2017-09-30发布2017-11-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.

2、4—2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本标准主要起草人：贾立军、梁晚枫、柴方红、黄国明、张魁、王海军。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2704—2017本标准仅供内部使用不得翻印牛卵形巴贝斯虫病检测方法PCR法1范围本标准规定了牛卵形巴贝斯虫病PCR检测方法的技术要求。本标准适用于牛卵形巴贝斯虫病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件

3、的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.1卵形巴贝斯虫病babesiosis本标准仅供内部使用不得翻印由牛卵形巴贝斯虫（Babesiaovata）寄生于牛的红细胞内，以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为主要特征的血液寄生虫病。4原理双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异

4、性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。5试剂和溶液除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。5.1试剂5.1.1TaqDNA聚合酶。5.1.2dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。5.1.3血液DNA提取试剂盒。5.1.4DNAMarker分子量标准。5.2常规试剂配制5.2.150×TAE缓冲液见附录A.1。5.2

5、.2加样缓冲液见附录A.2。1DB22/T2704—20175.2.310mg/mL溴化乙锭见附录A.3。5.2.41%琼脂凝胶见附录A.4。5.3引物本标准仅供内部使用不得翻印PCR反应引物序列与浓度见表1。表1PCR反应引物序列与浓度引物引物序列DNA序列长度/bp浓度/pmol/μL上游引物5’-GCCCGCAGGTCATCATAAAGT-3’AB367928.1100810下游引物5’-CATTTTGTGCCAGCGTTTTG-3’5.4仪器设备5.4.1PCR扩增仪,温度范围：4℃～100℃。

6、5.4.2低温高速离心机,12000r/min以上。5.4.3高压灭菌器,120℃以上。5.4.4恒温水浴锅,室温～100℃。5.4.5分析天平,感量0.1mg。5.4.6电泳槽,水平电泳槽。5.4.7电泳仪,电压1V～300V；电流1mA～400mA。本标准仅供内部使用不得翻印5.4.8凝胶成像系统,带紫外灯。5.4.9微量加样器,单道2μL、10μL、20μL、100μL和200μL。5.5试验样品对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室检测。6试验步骤

7、6.1模板DNA制备按血液基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA见附录B。6.2检测血样PCR反应在PCR反应管中按表2依次加入反应试剂，反应体系为25µL。反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火60s，72℃延伸50s，循环30次；72℃延伸7min，4℃保存。表2PCR检测反应体系试剂体积10×PCR缓冲液2.5µL2.5mmol/LdNTP2.0µL表2（续）2DB22/T2704—2017试剂体积10µmol/L上游引物1.0µL10µmol/L下游引物本标准仅供

8、内部使用不得翻印1.0µL5U/µLTaq酶0.25µL25mg/LDNA模板2.0µL灭菌双蒸水16.25µL总体积25µL6.3对照PCR反应在试样PCR反应的同时，设置标准阴性对照、标准阳性对照和空白对照，各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与6.2相同。以未感染卵形巴贝斯虫牛血液中提取的DNA作为标准阴性对照PCR反应体系的模板；以卵形巴贝斯虫感染牛的血液提取的DNA作为标准阳性对照PCR反应体系的模板；以无菌双