DB22∕T 2705-2017 牛瑟氏泰勒虫病检测方法 LAMP法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：56318-2017DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2705—2017牛瑟氏泰勒虫病检测方法LAMP法LAMPassayfordetectionofbovineTheileriasergenti本标准仅供内部使用不得翻印2017-09-30发布2017-11-30实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2705—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出

2、的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林省动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。本标准主要起草人：贾立军、张守发、梁晚枫、柴方红、张魁、王海军。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2705—2017本标准仅供内部使用不得翻印牛瑟氏泰勒虫病检测方法LAMP法1范围本标准规定了牛瑟氏泰勒虫病LAMP检测方法的技术要求。本标准适用于牛瑟氏泰勒虫病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所

3、注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.1瑟氏泰勒虫病theileria本标准仅供内部使用不得翻印sergenti由泰勒科、泰勒属的瑟氏泰勒虫寄生于牛体内引起的以高热、贫血、出血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状的一种血液原虫病。4原理环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplificationLAMP)：针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在62℃

4、～65℃等温条件下，保温30min～60min，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，即而完成的核酸扩增反应。5试剂和溶液除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。5.1试剂5.1.1BstDNAPolymerase。5.1.2SYBRGreenⅠ。5.1.3限制性内切酶TaqⅡ。5.1.4血液DNA提取试剂盒。5.1.5溴化乙锭。5.1.6DNAMarker分子量标准。5.2常规试剂配制1DB22/T2705—20175.2.1100mg/mL溶菌酶见附录A.1。5.2.210mg/m

5、L蛋白酶K见附录A.2。5.2.310%十二烷基磺酸钠见附录A.3。本标准仅供内部使用不得翻印5.2.45%十六烷基三甲基溴化铵见附录A.4。5.2.5TE（pH8.0）见附录A.5。5.2.650×TAE缓冲液见附录A.6。5.2.7加样缓冲液见附录A.7。5.2.81.5%琼脂糖凝胶的制备见附录A.8。5.3引物LAMP反应引物序列与浓度见表1。表1LAMP特异性引物序列及浓度引物引物序列DNA序列浓度F3TCGCCCACAGACTTAAGCA0.2µmol/LB3GAATGGTCCGACGAAGTCATP33基因0.2µmo

6、l/L（D87198）FIPGTGCATATCCGAACTGAACCCACTCATGCCAAGCCACTCT1.6µmol/LBIP本标准仅供内部使用不得翻印AGGAAACCAAGGATCTCGATGCGGCATCAGCAGCAAAAAGAC1.6µmol/L5.4仪器设备5.4.1低温高速离心机，12000r/min。5.4.2恒温水浴锅，室温～100℃。5.4.3分析天平，感量0.1mg。5.4.4电泳槽，水平电泳槽。5.4.5电泳仪，电压1V～300V，电流1mA～400mA。5.4.6凝胶成像系统（带紫外灯）。5.4.7微

7、量加样器，单道2μL、10μL、20μL、100μL、200μL和1000μL。5.5试验样品对无菌采集的待检牛血液样品，封装于洁净塑料离心管或玻璃试管内，编号。冷藏条件下送实验室检测。5.6标准样品标准阳性样品为牛瑟氏泰勒虫基因组DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。制备方法见附录B。标准阴性样品为无瑟氏泰勒虫感染牛血液DNA提取物，DNA浓度为10mg～30mg。6试验步骤6.1LAMP反应体系，按表2依次加入反应试剂，总体系25µL。6.2同时设置阳性对照、阴性对照和水对照。6.3LAMP反应条件，63℃反应60mi

8、n，80℃2min终止反应。2DB22/T2705—2017表2LAMP反应体系加样物浓度体积本标准仅供内部使用不得翻印DNA模板10mg～30mg2µLMgSO46.0mmol/L3µLdNTP1.4mmol/L3.5µLF30.2µmol/L1