DB22∕T 3093-2019 肝吸虫囊蚴检测 荧光定量PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3093—2019肝吸虫囊蚴检测荧光定量PCR法etectionmethodofrealtimequantitativePCRforClonorchissinensismetacercaria本标准仅供内部使用不得翻印2019-12-25发布2020-02-01实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3093—2019本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009给

2、出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、宫鹏涛、郭衍冰、董航、苑淑贤、姚新华、程荣华、邵洪泽、程敏、李文东、李金龙、赵玉龙。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T3093—2019本标准仅供内部使用不得翻印肝吸虫囊蚴检测荧光定量PCR法1范围本标准规定了肝吸虫囊蚴荧光定量PCR检测方法的技术要求。本标准适用于肝吸虫囊蚴的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注

3、日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3缩略语本标准仅供内部使用不得翻印下列缩略语适用于本文件。SYBRGreenI：一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（SYBRGreenNdcleicAcidGelStains）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）Ct值：循环阈值

4、（Cyclethreshold）4原理根据肝吸虫囊蚴基因特定的序列设计合成一对特异性引物，在反应体系中SYBRGreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强弱，实现对目的基因的准确定量。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5试验条件5.1生物安全措施所有培养物和废弃物的处置应符合GB19489的规定执行。5.2防污染措施防止污染措施应符合GB/T27401的规定。6试剂和材料1DB22/T3093—20196.1试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验

5、用水符合GB/T6682中一级水的要求。6.1.1动物组织基因提取试剂盒。本标准仅供内部使用不得翻印6.1.2阳性对照，为肝吸虫囊蚴DNA，或含有附录A.3序列的质粒DNA。6.1.3阴性对照，为ddH2O。6.1.4SYBRGreenqPCRMasterMix（2×）。6.1.5ROXReferenceDye（50×）。6.2耗材6.2.1荧光定量PCR反应管。6.2.2离心管，1.5mL、0.5mL、0.2mL。6.2.3吸头，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL

6、。6.3引物上游引物P1：5'-TCTGGGTAGGGTGGTTTGA-3'下游引物P2：5'-ATAGACGCTCCCGAGTTCC-3'使用时配制成10μmol/L工作液，置-20℃保存，6个月内使用。7仪器本标准仅供内部使用不得翻印7.1分析天平，感量0.1g。7.2研钵。7.3高速冷冻离心机，12000r/min以上。7.4荧光定量PCR仪。7.5高压蒸汽灭菌器。7.6微量移液器，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL。7.7恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃

7、。7.8冰箱，-20℃±2℃。8样品采集不少于500mg（7.1）肝吸虫囊蚴宿主的肌肉，避免污染。样品应-20℃保存，冷藏运输，不能在24h内送达实验室的样品应冷冻状态运送。9操作步骤9.1模板的制备样品研磨均匀（7.2），采用动物组织基因提取试剂盒（6.1.1）提取待检样品、阳性对照（6.1.2）、阴性对照（6.1.3）DNA作为模板，操作方法按说明书进行。9.2反应体系2DB22/T3093—2019采用25μL反应体系，在荧光定量PCR反应管（6.2.1）中依次加入表1所示的试剂后，盖紧管盖，瞬时离心混匀（7.

8、3），避免产生气泡，做好标记，置于荧光定量PCR仪（7.4）中扩增。本标准仅供内部使用不得翻印表1荧光定量PCR反应体系成分用量/μLSYBRGreenqPCRMasterMix12.5P11.5P21.5ROXReferenceDye0.5DNA模板2.0ddH2O7.0总计25.09.3反应程序——第一阶段，95℃预变性5min；——第二阶