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时间:2020-03-19
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1、实验四T-A连接(克隆)赵建军张龚炜2018.10.20一、实验目的学习和掌握DNA连接的原理和方法理解T-A连接的优缺点理解蓝白斑筛选的原理和方法二、实验原理DNA连接反应(transformation)利用DNA连接酶把载体DNA和要克隆的目的DNA片段连接在一起,成为一个完整的重组分子。载体(vector),指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。T-载体:聚合酶链反应(PCR)产物的克隆载体,两侧3′端各多出一个脱氧胸腺嘧啶核苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通
2、常含单个脱氧腺嘌呤核苷酸(A),与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。二、实验原理二、实验原理自制T载体:XcmI:5’-CCANNNNNˇNNNNTGG-3’二、实验原理一些载体(如PUC系列质粒)带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和N端α片段146个氨基酸的编码信息。该编码区中含有多克隆位点,可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码lacZC端ω片段的突变宿主细胞。因此,虽然宿主和质粒编码的片段都没有lacZ活性,但它们同时存在时,α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。由α-互
3、补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的作用下,在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。二、实验原理而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地破坏α片段的编码,使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选,称为蓝白斑筛选。三、T-A连接(克隆)的材料材料准备:特定的基因工程感受态大肠杆菌、具有LacZ筛选标记的T-载体仪器:超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅三、T-A连接(克隆)的材料材料:特定的感受态大肠杆菌(DH5a、DH5b、Top10、Bl21等)PCR试剂、
4、DNA纯化试剂盒、T载体、DNA连接酶、X-Gal、IPTG。LB平板(Amp抗性):蛋白胨1%,酵母粉0.5%,NaCl1%,琼脂1.5%,0.5mg/mlAmp。三、T-A连接(克隆)的材料四、T-A连接(克隆)的过程PCR反应体系(ReactionAssembly):Component50µLNuclease-freeWater23µL(to50µL)2XPCRMix25µL模板DNA(pC-mChr)1µLPrimerMix1µLMixThoroughlyandSpin.1.克隆DNA片段的准备:PCR反应四、T-A连
5、接(克隆)的过程PCR产物纯化:离心柱法结合:加入5倍体积的结合液,混合;过柱:将PCR产物-结合液混合物加入离心柱,12000rpm离心1min,弃收集液;漂洗:向离心柱中加入600ul漂洗液,12000rpm离心1min,弃收集液,重复一次,12000rpm离心3min;洗脱:离心柱套入一个1.5mlEP管,向离心柱加入20ul超纯水,停留2min,12000rpm离心1min,将收集液返回离心柱,重复离心3min,保留收集液(纯化DNA产物)备用。1.克隆DNA片段的准备:PCR产物纯化四、T-A连接(克隆)的过程连接反
6、应体系(ReactionAssembly):Component10µLNuclease-freeWater5.5µL(to10µL)T-Vector1µL纯化PCRProduct2µL10×LigaseBuffer1µLT4Ligase0.5µLMixThoroughlyandSpin.2.T-A连接:PCR产物-T载体连接16-24℃连接2-10h四、T-A连接(克隆)的过程3.连接产物转化大肠杆菌并通过蓝白斑筛选和抗性筛选阳性克隆。IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)40ulX-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-
7、半乳糖苷)40ul转化菌液40ul混合涂板,37℃培养过夜(16h以上)。谢谢!
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