应用_酶切连接_克隆法构建TALEs

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1、第３１卷第３期石河子大学学报（自然科学版）Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．３２０１３年６月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）Ｊｕｎ．２０１３文章编号：１００７－７３８３（２０１３）０３－０３０６－０７应用“酶切－连接”克隆法构建ＴＡＬＥｓ梁龙１，杨华２，３，杨永林２，３，石国庆２，３，刘守仁２，３，皮文辉２，３（１石河子大学动物科技学院，石河子８３２００３；２新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，石河子８３２０００；３新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室，石河子８３２０００）摘要：ＴＡＬＥｓ是在植物病原菌黄单胞杆菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）上发现的一类天然的ＤＮＡ结

2、合蛋白，其重复域已经成为模块化构建单元，用于人工ＤＮＡ结合蛋白的构建。人工ＴＡＬＥｓ能够用于多种基因工程操作，包括转录调节和基因组编辑。为了在常规分子生物学实验室稳定、经济地构建ＴＡＬＥ－ＴＦｓ和ＴＡＬＥＮｓ，本文采用ＴＡＬＥＴｏｏｌｂｏｘ试剂盒，运用ＰＣＲ扩增和“酶切－连接”克隆法构建人工ＴＡＬＥｓ。结果表明，该构建策略是一种快速高效构建ＴＡＬＥｓ的方法，能够在１周内完成ＴＡＬＥｓ构建。关键词：转录激活因子样效应子；“酶切－连接”克隆法中图分类号：Ｑ７８；Ｑ５０３文献标志码：ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＴＡＬＥｓｂｙ′Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ－Ｌｉｇａｔｉｏｎ′Ｃｌｏｎｉｎｇ１，ＹＡＮＧＨｕａ

3、２，ＹＮＡＧＹｏｎｇｌｉｎ２，ＳＨＩＧｕｏｑｉｎｇ２，ＬＩＵＳｈｏｕｒｅｎ２，ＰＩＷｅｎｈｕｉ２ＬＩＡＮＧＬｏｎｇ（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３，Ｃｈｉｎａ；２ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＸｉｎｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＲｅｃｌａｍａｔｉｏｎＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２０００，Ｃｈｉｎａ；３ＫｅｙＬａｂｏｆＳｈｅｅｐＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＸｉｎｊｉａｎｇＡｇｒｏｒｅｃｌａｍａｔ

4、ｉｏｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴＡＬＥｓ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）ａｒｅａｃｌａｓｓｏｆｎａｔｕｒａｌｌｙＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ．ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄｒｅｐｅａｔｄｏｍａｉｎｓｏｆＴＡＬＥｈａｖｅｂｅｅｎｕｓｅｄａｓｍｏｄｕｌａｒｂｕｉｌｄｉｎｇｕｎｉｔｓｆｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｕｓ－ｔｏｍｉｚｅｄＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＴＡＬＥｓｃａｎｂｅｕｓ

5、ｅｄｆｏｒａｗｉｄｅｖａｒｉｅｔｙｏｆｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｒａｎ－ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｍｏｄｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ．ＴｈｅａｒｔｉｃｌｅｄｅｓｃｒｉｂｅｓｐｒｏｃｅｓｓｆｏｒｒｅｌｉａｂｌｅａｎｄａｆｆｏｒｄａｂｌｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＴＡＬＥ－ＴＦｓａｎｄＴＡＬＥＮｓｂｙｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ′ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ－ｌｉｇａｔｉｏｎ′ｃｌｏｎｉｎｇｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＴＡＬＥＴｏｏｌｂｏｘｋｉｔ．Ｔｈｅｒｅ－ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃ

6、ｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｉｓｆａｓｔａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ａｎｄＴＡＬＥｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｃｏｍｐｌｅｔｅｄｗｉｔｈｉｎ１ｗｅｅｋ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＴＡＬＥｓ；ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ－ｌｉｇａｔｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇＴＡＬＥｓ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｓ，被命名为重复可变区（ｒｅｐｅａｔｖａｒｉａｂｌｅｄｉｒｅｓｉｄｕｅ，［１］ＴＡＬＥｓ）是植物致病菌黄单胞杆菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）ＲＶＤ）。每个重复单元中的ＲＶＤ和识别的脱氧通过ＩＩＩ型分泌系统注入到宿主细胞内的一类蛋白核苷酸碱基呈现对应关系，如ＮＩ（Ａｓｎ／Ｉｌｅ）对

7、应Ａ、效应子。ＴＡＬＥ－ＤＮＡ结合结构域由串联重复模块ＮＧ（Ａｓｎ／Ｇｌｙ）对应Ｔ、ＨＤ（Ｈｉｓ／Ａｓｐ）对应Ｃ、ＮＮ［２－３］组成，大部分重复单元含３４（３３～３５）个氨基酸，重（Ａｓｎ／Ａｓｎ）对应Ｇ／Ａ，ＮＫ（Ａｓｎ／Ｌｙｓ）对应Ｇ［４－５］［６］和ＮＨ（Ａｓｎ／Ｈｉｓ）对应Ｇ。ＴＡＬＥ－ＤＮＡ复合复单元的第１２和１３位点氨基酸呈现高度多态，其体的三维结构研究结果表明，ＲＶＤ的第１位氨基酸他位点的氨基酸