具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究.pdf

《具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、具有0c一葡萄糖苷酶抑制活性的海绵共附生微生物及其活性产物研究摘要海绵共附生微生物是寻找和开发天然活性产物的重要来源之一，是研制糖尿病新型药物(0【．葡萄糖苷酶抑制剂)的有效途径。本研究通过建立0【．葡萄糖苷酶活性抑制剂筛选模型，对美国圣璜岛海域海绵的附生微生物发酵产物进行活性筛选。其中，0【．葡萄糖苷酶活性测试体系是在96孔酶标板中进行，在O【．葡萄糖苷酶浓度为0．008U／mL，pH值为6．8，反应温度37。C，测定产物波长为405nm的基础上，优化筛选模型。结果表明，模型的最佳筛选条件：底物PNPG浓度为10mmol／L、活性测试反应时间为25min，以及样品溶剂

2、DMSO含量为2％V／V。以0【．葡萄糖苷酶抑制剂阿卡波糖作为阳性对照样品，利用上述优化后的抑制活性筛选模型，对212株海绵微生物的粗提物样品进行筛选。结果表明：19株微生物的粗提物抑制率大于50％；其中，对于抑制活性最高的5株菌的粗提物，在浓度为0．4、0．6或0．8rag／mE时，其抑制活性均在70％以上，远远高于阿卡波糖的最高抑制率58％(1．6mg／mL)。其中菌株HY936粗提物浓度在0．4mg／mL$-j，仍具有很高的0【．葡萄糖苷酶抑制率79．3％。并对菌株HY936进行16SrDNAi贝U序及分析，鉴定该菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)

3、。本研究还对活性菌株Bacillusfirmus的培养条件进行了优化。采用的单因素试验设计，以培养时间，摇床转速，接种量作为分析因素；正交试验验设计L9(34)，以蛋白胨、酵母膏、NaCl和pH值作为分析因素；从实验结果中确定适合菌株Bacillusfirmus生长的最佳条件。然后，对菌株进行批量发酵，收集到粗提物2．89，将其代谢产物通过硅胶薄层层析，高效分析液相等方法分离纯化。其中，硅胶柱粗分得到的组分Fr．1和Fr．4具有很高的0【一葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率分别为35．5％、19．6％。对组分Fr．1作进一步的分离纯化，得到的组分II对O【．葡萄糖苷酶的抑制率达

4、82．38％。通过GC．MS鉴定出组分II中的11种化合物，主要成分是环二肽类和哌啶酮类物质，这为研制新型Cc．葡萄糖苷酶抑制剂提供了有力的线索，对这两类物质有待作进一步的研究。关键词：海绵共附生微生物；n．葡萄糖苷酶抑制剂；分离纯化；活性化合物伐一glycosidaseinhibitorderivedfrommarinesponge--associatedmicroorganismsAbstractMarinesponge．associatedmicroorganismsaretheimportantsourceofnatureproductsforpharmaceu

5、ticals．Itisapotentialwayfordevelopingnewdiabetesdrug(0【。glycosidaseinhibitor)·Inthisstudy,thea。glucosidaseinhibitoryactivityscreeningmodelisbuilt—uptosearchfortheactivecrudeextractfromthemicroorgainismmetabolitesamplespreparedfrommarinespongesinFridayharborofUS．Thereactionsystemofthe0【-g

6、lucosidaseinhibitoryactivityscreeningisperformedona96wellsplates．Thereactioncondition，includingtheconcentrationofenzymes，issetat0．008U／mL，pH6．8，37。C，andwavelength405nm．Moreover,thescreeningmodelwasoptimizedwithreactantPNPGconcentration10mmol／L，reactiontimeof25minandthesolventDMSOcontento

7、f2％(∥功UsedAcarboseasapositivecontrolledsample，212crudeextractssamplesfrommarinespongeassiciatedmicroorganismswerescreenedwiththeaboveoptimizedmodel．Theresultsindicatedthatmetabolitesof19strainshadhighinhibitioryactivity(>50％)．Amongthem，5strainsshowedinhibitoryeffecthigher